孟加拉国水牛乳腺炎中广泛耐药和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物膜产生与毒力特征分析

《Scientific Reports》：Biofilm production and virulence traits among extensively drug-resistant and methicillin-resistant Staphylococcus aureus from buffalo subclinical mastitis in Bangladesh

本研究针对孟加拉国贾马尔普尔地区水牛亚临床乳腺炎(SCM)中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行情况展开调查。研究人员通过表型和基因型方法，揭示了MRSA分离株的高耐药率（四环素80%、头孢西丁80%）和毒力基因携带情况（hla 66.7%、sea 50%）。研究发现60%的MRSA为广泛耐药(XDR)菌株，60%具备生物膜形成能力，且多重抗生素耐药指数(MARI)高达0.92。该研究为制定水牛乳腺炎防控策略和抗生素合理使用提供了重要科学依据，对保障动物和公共卫生安全具有重要意义。

　　

在孟加拉国的畜牧业中，水牛养殖作为农村经济的重要支柱，为全国奶制品供应做出了显著贡献。然而，亚临床乳腺炎(Subclinical Mastitis, SCM)这一隐蔽的威胁正悄然侵蚀着水牛的健康与生产力。与临床表现明显的乳腺炎不同，SCM缺乏可见症状，却导致牛奶产量下降和质量受损，造成巨大的经济损失。更令人担忧的是，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)作为SCM的主要病原体之一，不仅对动物健康构成威胁，还可能通过食物链传播给人类，引发严重的公共卫生问题。

长期以来，MRSA被称为"超级细菌"，其对多种抗生素的耐药性使得治疗变得异常困难。在孟加拉国贾马尔普尔这样的水牛主产区，关于水牛SCM中MRSA的流行情况、耐药特性及毒力特征的系统研究尚属空白。这一问题亟待解决，因为了解当地MRSA的流行病学特征对于制定有效的防控策略至关重要。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，Shalidur Rahman Chowdhury等研究人员对贾马尔普尔地区四个Upazila（Bakshiganj、Dewanganj、Islampur和Jamalpur Sadar）的344份水牛奶样进行了系统分析。研究采用加州乳腺炎试验(California Mastitis Test, CMT)和改良怀特赛德试验(Modified Whiteside Test, MWST)进行SCM的初步筛查，随后通过培养、生化试验和PCR方法对病原体进行鉴定和特征分析。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：通过CMT和MWST进行SCM的现场快速筛查；使用选择性培养基（甘露醇盐琼脂）和标准生化试验分离鉴定金黄色葡萄球菌；采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗生素敏感性测试；通过PCR技术检测耐药基因（mecA、tetA、aac(3)-iv、sul1等）和毒力基因（hla、sea、icaA、fnbA等）；利用刚果红琼脂(Congo Red Agar, CRA)和结晶紫微孔板(Crystal Violet Microtiter Plate, CVMP) assay评估生物膜形成能力。

SCM患病率基于CMT评分

研究发现，在344份季度奶样中，CMT检测出160份(46.5%)为SCM阳性。不同地区的患病率存在差异，其中Dewanganj Upazila的患病率最高(54.8%)，而Islampur最低(34.1%)。在动物水平上，总体患病率为55.8%，其中Dewanganj地区高达71.4%。这些数据表明SCM在当地水牛群中普遍存在，且地区间差异可能与饲养管理条件和环境因素有关。

通过不同方法鉴定病原体

通过综合运用MWST、CMT、培养、生化和分子方法，研究成功从奶样中鉴定出病原体。在77株葡萄球菌分离株中，PCR确认73株(21.2%)为葡萄球菌属。其中30株(41.1%)被鉴定为金黄色葡萄球菌，43株(58.9%)为非金黄色葡萄球菌(Non-aureus Staphylococci, NAS)。值得注意的是，在30株金黄色葡萄球菌中，10株(33.3%)为MRSA，相当于总奶样患病率的2.9%。右后(RR)乳区金黄色葡萄球菌检出率最高(57.1%)，而MRSA在右前(RF)乳区占比最高(60.0%)。

MRSA的抗生物谱以及毒力和抗生素耐药基因的分布

抗生素敏感性测试显示，MRSA分离株对多种抗生素表现出高度耐药性。对氨苄青霉素、四环素和头孢西丁的耐药率均达80%，对阿奇霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素的耐药率为70%，对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑的耐药率为60%。分子分析进一步证实了这些表型结果，在MRSA分离株中，tetA(80%)、aac(3)-iv(70%)和sul1(50%)等耐药基因的携带率较高。

在毒力基因方面，hla(66.7%)和sea(50%)是金黄色葡萄球菌分离株中最常见的毒力基因，而icaA的检出率为23.3%。fnbA基因在所有分离株中均未检测到。MRSA和MSSA(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)在hla(70.0% vs 65.0%)和sea(均为50.0%)的携带率上相似。

金黄色葡萄球菌和MRSA的耐药性决定因素

研究发现，53.3%的金黄色葡萄球菌分离株表现为多重耐药(Multidrug-Resistant, MDR)，30%为广泛耐药(Extensively Drug-Resistant, XDR)。在MRSA组中，XDR比例高达60%，其中一株分离株对8类12种抗生素耐药，MARI值达0.92，显示出极高的耐药负担。这些XDR菌株通常同时携带多种耐药基因，如aac(3)-iv、tetA、sul1和strA等。

生物膜产生及其与毒力和耐药基因的关联

生物膜形成能力评估显示，60%的MRSA阳性分离株具有生物膜形成能力。其中，33.3%为强生物膜生产者，50%为中等生产者，16.7%为弱生产者。热图分析表明，生物膜形成能力与多药耐药性之间存在潜在关联，大多数生物膜产生菌株被归类为MDR或XDR。强和中度生物膜生产者经常共表达icaA、hla和sea等毒力基因，以及tetA、sul1和aac(3)-iv等耐药基因。

本研究系统揭示了孟加拉国贾马尔普尔地区水牛SCM中MRSA的严重流行情况和耐药特性。研究发现的高MDR/XDR流行率、生物膜形成能力以及毒力基因的广泛存在，凸显了这一问题对动物和公共卫生的双重威胁。MRSA分离株对常用抗生素的高耐药率，特别是对四环素(80%)和头孢西丁(80%)的耐药性，表明当前治疗策略可能已不足以有效控制感染。

生物膜形成能力与多药耐药性的关联尤为值得关注，因为生物膜可以保护细菌免受抗生素和宿主免疫系统的攻击，导致持续性感染。icaA基因在部分分离株中的检测进一步支持了这一观点，因为该基因与生物膜的多糖细胞间粘附素合成直接相关。

从公共卫生角度，水牛奶中MRSA的存在构成了潜在的人畜共患传播风险。特别是那些携带多种毒力基因(如hla、sea)和耐药基因的菌株，可能通过食物链传播给人类，引起难以治疗的感染。

这项研究为制定针对水牛SCM的综合防控策略提供了重要科学依据。研究结果强调需要加强抗生素的合理使用、改善饲养管理措施，并建立持续的监测系统。农民教育也至关重要，包括提高对SCM认识、推广卫生挤奶实践以及避免抗生素滥用。

未来的研究应扩大样本量和地理覆盖范围，并纳入基因组分析以更好地了解菌株间的遗传关系和传播动态。此外，探索替代疗法和预防措施，如使用益生菌或疫苗，可能有助于减少对抗生素的依赖，从而减缓耐药性的发展。

总之，这项研究不仅填补了孟加拉国水牛SCM中MRSA研究的空白，也为制定基于One Health（一体化健康）理念的防控策略提供了关键数据，对保障动物健康、食品安全和公共卫生安全具有重要意义。