从苦橙花中回收酚类化合物：采用天然深共晶溶剂与超声波协同提取技术，结合吸附纯化方法，并通过UPLC/Q-TOF-MS/MS进行分析

《Ultrasonics Sonochemistry》：Green recovery of phenolics from bitter orange flowers: Natural deep eutectic solvent-ultrasound synergistic extraction, adsorptive purification, and UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis

苦橙花（BOF）中总多酚（BOF-TP）的绿色高效提取与纯化策略研究。采用自然深共熔溶剂-超声协同提取（NADES-USE）结合AB-8树脂吸附纯化，优化参数为38%水含量ChCl-EG溶剂、18 mL/g液固比、345 W超声功率、43 min提取时间及55℃温度，总多酚提取率达104.58±0.34 mg/g，较传统溶剂提高1.3-2.16倍。AB-8树脂吸附性能最佳，纯化后产物多酚纯度达75.62±0.95%，并通过UPLC-Q/TOF-MS/MS鉴定出7种活性成分。该集成工艺符合绿色化学原则，为苦橙花资源开发提供新方法。

　　本文聚焦于苦橙花（Bitter Orange Flowers, BOF）中总黄酮（BOF-TP）的高效提取与纯化，旨在探索一种环保、可持续的策略，以支持其在食品和制药领域的应用。苦橙花作为传统中药和食品香料，其富含黄酮类化合物、酚酸类物质以及其他具有药理活性的成分，因此在健康和工业应用中展现出巨大潜力。然而，目前对于苦橙花中黄酮类化合物的高效提取和纯化技术仍存在研究空白，本研究通过结合自然深共熔溶剂-超声波协同提取（NADES-USE）与吸附纯化方法，构建了一个系统的提取与纯化平台，从而实现对苦橙花中总黄酮的高效回收。此外，通过超高效液相色谱-四级杆-时间飞行质谱/质谱（UPLC-Q/TOF-MS/MS）技术对提取物进行了全面的化学表征和七个活性化合物的同步定量分析，为BOF-TP的品质控制提供了新的评估标准。

### 1. 背景与研究意义

苦橙花，也称为酸橙花，是柑橘属植物苦橙（*Citrus aurantium* L.）的花朵，原产于东南亚地区，现广泛种植于热带和亚热带地区。除了作为药用植物，苦橙花还因其在饮料、食品、制药和化妆品工业中的广泛应用而具有显著的商业价值。其花朵被称为“大花”，在中国传统医学中，苦橙花常用于治疗胸闷、食欲不振、呕吐和胃痛等症状。近年来，药理研究表明，苦橙花具有抗遗忘、抗菌、抗氧化、镇痛、抗炎等有益特性，并能缓解痛经。从化学成分的角度来看，苦橙花富含黄酮类化合物（如儿茶素、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮素、新柚皮素和橙皮素）、生物碱、挥发油和多糖等物质。其中，黄酮类化合物因其显著的药理活性而受到广泛关注，因此深入研究苦橙花中的黄酮类成分对于进一步开发其资源具有重要意义。

传统的提取方法，如回流提取和煎煮，虽然已被广泛应用，但存在提取效率低、能耗高、操作成本高、处理时间长以及可能导致活性成分热降解等局限性。为了克服这些限制，近年来出现了许多创新的提取技术，特别是非热技术，如超声波辅助提取（UAE）。超声波辅助提取通过高频率声波（通常在20到100 kHz之间）产生空化效应，从而增强目标成分的释放。这种方法具有高效、低成本、操作可靠和易于规模化生产等优势，成为最有效的提取方法之一。然而，传统溶剂（如水、乙醇）的非选择性使得目标成分与基质杂质同时溶解，从而降低提取选择性。此外，有毒的有机溶剂（如甲醇、乙醚和丙酮）对生态和职业健康构成严重威胁。因此，开发一种绿色、环保且高效的提取和纯化方法成为当前研究的重要方向。

自然深共熔溶剂（NADESs）作为传统溶剂的可持续替代品，因其绿色化学特性而受到广泛关注。NADESs通常由氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBAs）组成，通过氢键作用形成均质液态混合物，其熔点比单一组分显著降低。NADESs具有可调的理化性质、制备简便、无毒、可生物降解、高可回收性以及良好的热稳定性，使其在提取应用中展现出巨大潜力。将NADESs与超声波结合的NADES-USE技术能够实现对植物化学成分的绿色、可持续提取，成为提取生物活性成分的前沿方法。同时，吸附纯化作为一种关键的中间步骤，能够有效去除杂质，提高目标成分的纯度，对后续应用至关重要。因此，本研究通过NADES-USE与吸附纯化技术的结合，旨在建立一个高效、环保的平台，用于苦橙花总黄酮的提取与纯化。

### 2. 材料与方法

#### 2.1 化学试剂与材料

本研究使用了多种化学试剂和植物材料。所有标准化合物均从上海源叶生物科技有限公司购得。Folin-Ciocalteu试剂从北京索莱宝科技有限公司获得。用于合成深共熔溶剂的化学试剂来自上海阿拉丁科技有限公司。AB-8树脂、HPD-400A树脂、DA201树脂等从北京索莱博科技有限公司采购，HPD-100树脂、D101树脂、S-8树脂和DM301树脂则从河北沧州博吸附科技有限公司购得。所有新购树脂均按照本研究前的实验方案进行预处理。具体的试剂和树脂规格见附表S1。

#### 2.2 植物材料

苦橙花样本于2024年5月从浙江省湖州市采集。采集后的花朵经50°C干燥后，研磨成粉末，并通过100目筛分，最终储存在密封容器中，用于后续实验分析。

#### 2.3 深共熔溶剂的制备

研究共合成了12种深共熔溶剂（DESs），选择氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBAs）在特定摩尔比例下进行混合。通过80°C持续搅拌至形成均匀透明的液态混合物后，将混合物在真空条件下干燥过夜，从而获得深共熔溶剂。具体使用的化学试剂及其摩尔比例如附表1所示。

#### 2.4 提取溶剂的筛选

为了筛选出最佳的提取溶剂，研究使用了三种常见溶剂（H2O、EtOH、70% EtOH）和12种合成的深共熔溶剂进行提取。将2.0 g苦橙花粉末分别浸泡在50 mL不同溶剂中，随后在50°C条件下使用KQ-500DB超声波发生器（昆山超声仪器有限公司）进行三次30分钟的超声波提取。提取后的样品通过Folin-Ciocalteu法测定总黄酮含量，以评估各溶剂的提取效率。实验过程如附图S1所示。

#### 2.5 NADES-USE参数的优化

为了进一步优化NADES-USE提取过程的关键参数，研究采用了响应面法（RSM）中的Box-Behnken设计（BBD）。选择水含量（X1）、液固比（X2）、超声波功率（X3）和提取时间（X4）作为影响总黄酮产量的主要变量。每个变量分别在三个水平（?1、0、1）进行测试，通过BBD设计获得29组随机实验数据。实验设计详情见附表S2和S3。

#### 2.6 静态吸附/解吸实验

通过静态吸附实验筛选出最佳吸附树脂。实验使用200 mL锥形瓶，每个瓶中加入40 mL含2.0 mg/mL BOF-TP的溶液和1.0 g（±0.01 g）的树脂（D101、HPD-100、AB-8、HPD-400A、S-8、DM301和DA201）。在25°C下，以120 rpm的恒定搅拌速率进行等温吸附实验。吸附后，用H2O进行解吸，随后使用95% EtOH进行解吸。吸附容量（Qe）、解吸容量（Qd）和解吸率（D）通过以下公式计算：

- 吸附容量（Qe）= (C0 - Ce) × Vs / m
- 解吸容量（Qd）= Cd × Vd / m
- 解吸率（D）= (Cd × Vd) / (C0 - Ce) × Vs × 100%

其中，C0和Ce分别表示初始和平衡浓度（mg/mL），Vs和Vd表示样品和解吸溶液的体积（mL），m为树脂质量（g）。

#### 2.7 AB-8树脂柱层析纯化

AB-8树脂被装入直径为20 mm的玻璃柱中，柱高与直径的比例为1:6.5，其填充体积（BV）约为40 mL。在吸附实验中，使用含2.0 mg/mL BOF-TP的粗提物以1、2、3和4 BV/h的流速进行上样。当流出液中BOF-TP浓度降至初始浓度的10%时，即为吸附的突破点。突破后，使用H2O、10% EtOH、40% EtOH、70% EtOH和95% EtOH依次进行解吸，每步解吸体积为5 BV，流速为2 BV/h。

#### 2.8 UPLC/Q-TOF-MS/MS分析

实验采用Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱系统，使用ZORBAX Eclipse Plus C18分析柱（2.1×100 mm，1.8 μm），在常温下进行分离。移动相为0.1%甲酸（A相）和0.1%甲酸的乙腈（B相），以0.3 mL/min的恒定流速进行。梯度洗脱程序如下：初始为20% B（0–5 min），随后线性增加至30% B（5–6 min），再逐步升高至75% B（6–8 min），之后返回初始条件，最后进行柱平衡（9–9.5 min）。样品进样量为0.5 μL。

色谱系统与Agilent G6546 Q-TOF质谱仪联用，使用电喷雾离子源（ESI）进行检测。质量数据采集采用自动MS/MS模式，扫描速率为2谱/秒。氮气作为干燥气体，以35 psi的雾化压力和8 L/min的流速进行。鞘气温度维持在350°C，流速为11 L/min。毛细管电压和喷嘴电压分别为3,500 V和1,000 V。MS/MS碎片化使用15 eV和35 eV的碰撞能量。所有测量均在正离子模式下进行，质量范围为50–800。

#### 2.9 统计分析

所有实验均进行三次重复，结果以均值±标准差表示。响应面设计和相关分析使用Design-Expert 13（Stat-Ease, Inc.）完成。吸附数据使用Origin 2024（OriginLab Corp.）进行处理和可视化。

### 3. 结果与讨论

#### 3.1 最佳提取溶剂的选择

本研究中，胆碱氯化物、甜菜碱和L-脯氨酸作为氢键受体（HBAs），而糖类、酸类和醇类作为氢键供体（HBDs）用于深共熔溶剂的制备。通过比较不同溶剂的提取效果，发现ChCl-EG（37.5%水含量）的总黄酮提取量最高，达到95.63±0.74 mg/g，其次是ChCl-TrG（91.61±0.35 mg/g）和ChCl-Gly（88.36±0.52 mg/g）。这些结果表明，基于胆碱氯化物的深共熔溶剂在苦橙花黄酮提取中表现更为优异，这与之前的文献研究一致。深共熔溶剂的结构对其提取效率至关重要，因为它直接影响其极性、物理化学相互作用和溶解性。根据“相似相溶”的原理，深共熔溶剂的极性对提取效率具有显著影响。在所有测试的溶剂中，ChCl-EG表现出优良的性能，表明其适合作为绿色溶剂进行进一步研究。

#### 3.2 单因素实验分析

单因素实验结果显示，水含量在20%到40%之间显著提高了总黄酮的提取量，但超过40%后提取量明显下降。这一趋势与之前在小米麸皮和苹果渣中使用NADES-USE提取黄酮的研究结果一致。适当的水含量可以降低溶剂的粘度，增强质量传递，从而提高目标化合物的提取量。液固比在10到20 mL/g之间对总黄酮提取量有显著提升作用，而进一步增加液固比则会对提取量产生负面影响。类似的结果也出现在大白菜叶和柑橘皮中黄酮的提取研究中。液固比不足可能导致提取不完全，而过高则会增加废料量并降低超声波能效。超声波功率在200–350 W之间对总黄酮提取量有显著提升作用，但超过350 W后，提取量开始下降。这一结果与之前在大白菜叶中黄酮提取的研究一致，表明适度增加超声波功率能够通过增强溶剂-样品相互作用提高提取效率。然而，过高的功率可能导致目标化合物的降解，从而降低提取量和质量。提取时间在10–40 min范围内显著提升总黄酮的提取量，但进一步延长提取时间会导致提取量下降。这一现象与之前在小米麸皮和大白菜叶中使用NADES-USE提取黄酮的研究一致。提取时间过长可能促进黄酮类成分的结构降解并增加杂质的共提取。提取温度在25–55°C范围内对总黄酮提取量有轻微提升作用，但随着温度的升高，提取量略有下降。整体来看，温度对总黄酮提取量的影响相对较小，因此选择了55°C作为最佳提取温度。

#### 3.3 基于RSM的NADES-USE优化

在单因素实验的基础上，研究进一步优化了NADES-USE的关键参数，包括水含量（X1）、液固比（X2）、超声波功率（X3）和提取时间（X4）。通过RSM分析，构建了一个二次多项式模型，并利用BBD实验数据进行多变量回归分析。ANOVA结果显示，二次模型具有高度显著性（F=84.06，p<0.0001），表明该模型能有效揭示响应与独立变量之间的关系。此外，模型的预测R2值为0.9377，与调整R2值0.9765高度一致，说明模型在实验变量范围内具有良好的一致性。

在响应面分析中，研究发现水含量、液固比、超声波功率和提取时间对总黄酮产量均具有显著影响，且这些变量之间的交互作用尤为突出。特别是液固比与超声波功率的交互作用对总黄酮产量的影响最大，其次是水含量与超声波功率的交互作用，以及超声波功率与提取时间的交互作用。通过优化实验参数，研究确定了最佳提取条件：水含量为38%，液固比为18 mL/g，超声波功率为345 W，提取时间为43 min。随后，通过验证实验，发现实际提取量为104.58±0.34 mg/g，与预测值104.70 mg/g高度一致，表明该模型具有良好的实用性。

#### 3.4 树脂筛选

通过静态吸附/解吸实验，研究筛选出AB-8树脂为最佳吸附树脂。实验结果显示，AB-8树脂的吸附容量最高，为72.30±0.91 mg/g，其次是HPD-100（68.73±1.33 mg/g）、D101（65.09±1.07 mg/g），而DA-201和DM301的吸附容量较低，分别为53.64±1.14 mg/g和55.42±0.87 mg/g。这些结果表明，弱极性和非极性树脂对苦橙花总黄酮的吸附能力显著高于强极性、极性和中等极性树脂，这与化学中的“相似相溶”原理一致。此外，研究还发现，对于极性相近的树脂，表面面积较大的树脂表现出更强的吸附性能。AB-8树脂虽然孔径小于S-8和D101树脂，但其吸附和解吸性能均优于其他树脂，因此成为提取苦橙花总黄酮的最佳选择。

#### 3.5 吸附等温线

吸附等温线实验表明，AB-8树脂对苦橙花总黄酮的吸附容量（Qe）随着温度的升高而显著下降，说明吸附过程为放热过程。此外，Qe随着初始浓度（C0）的增加而逐渐上升，这可能是由于酚类分子在树脂表面的结合位点增加所致。然而，当初始浓度增加至2.0 mg/mL时，Qe的增加速率显著下降，这可能与树脂结合位点的逐渐饱和有关。因此，选择2.0 mg/mL作为粗提物的初始浓度进行后续研究。

吸附等温线数据拟合了Langmuir、Freundlich和Temkin模型。在所有温度下，Langmuir模型的R2值均高于Freundlich和Temkin模型，表明该模型更准确地描述了苦橙花总黄酮在AB-8树脂上的单层吸附过程。此外，随着温度的升高，Langmuir模型估算的Qm值下降，表明低温更有利于吸附。Freundlich模型的Kf值也随温度升高而降低，进一步支持了吸附过程的放热特性。Temkin模型描述了吸附过程中吸附质与吸附剂表面结合能的线性下降，这与温度升高导致结合能减弱的现象一致。

#### 3.6 吸附热力学

热力学分析显示，苦橙花总黄酮在AB-8树脂上的吸附过程为自发（ΔG<0）和放热（ΔH<0）过程，主要由物理吸附主导（|ΔH|<43 kJ/mol）。这表明吸附过程在热力学上是可行的，并且随着温度的升高，吸附的自发性下降，而ΔS为负值，说明吸附过程中分子的有序性增加。这些结果进一步支持了吸附过程的物理吸附特性。

#### 3.7 吸附动力学

吸附动力学实验表明，AB-8树脂对苦橙花总黄酮的吸附过程在前2小时内迅速上升，随后逐渐放缓，最终在210分钟达到平衡。这可能是由于树脂表面初始结合位点较多，而随着吸附过程的进行，结合位点逐渐饱和，导致吸附速率下降。通过拟合伪一级反应（PFO）、伪二级反应（PSO）和内扩散（IPD）模型，发现PSO模型与实验数据的拟合效果最好，其R2值为0.9888，优于PFO模型（R2=0.9462）。此外，IPD模型的拟合曲线显示多个阶段，表明吸附过程不仅受内扩散影响，还受到边界层扩散和表面吸附的共同作用。

#### 3.8 吸附纯化

吸附纯化实验表明，较低的流速有助于提高苦橙花总黄酮的吸附效率，而较高的流速则会导致吸附不完全。在流速为1、2、3和4 BV/h的情况下，突破点分别出现在15、13、9和6 BV处。综合考虑通量和效率，选择2 BV/h作为最佳纯化流速。通过梯度洗脱实验，研究发现H2O和10% EtOH主要去除极性杂质，而40% EtOH能有效收集富含黄酮的组分，70% EtOH部分洗脱黄酮。95% EtOH仅能回收少量黄酮，因为大部分黄酮已在之前的洗脱步骤中被回收。基于这些结果，确定最佳收集区间为11到18 BV。

#### 3.9 UPLC-Q/TOF-MS/MS分析

通过优化移动相、洗脱程序和柱温，实验成功实现了对苦橙花总黄酮提取物的全面化学表征和七个主要活性黄酮的同步定量分析。附图6显示了纯化前后的总离子色谱图（TIC），表明纯化过程有效去除了7–9分钟范围内洗脱的杂质。纯化后，黄酮类化合物的色谱图显著改善，验证了AB-8树脂在该应用中的有效性。实验共鉴定出18种植物化学成分，其中七个主要活性黄酮包括儿茶素、柚皮苷、柚皮素、新橙皮苷、橙皮苷、新柚皮素和橙皮素。这些化合物的保留时间、质量误差和特征离子均在附表6中列出。

定量分析结果显示，新柚皮素在纯化后的提取物中占主导地位，含量为18.52±0.10%，其次是柚皮素（11.26±0.17%）和橙皮苷（8.11±0.24%）。这七种化合物共同占纯化提取物总质量的55.12%，为苦橙花总黄酮提取物的质量控制提供了参考标准。

### 4. 结论

本研究成功开发了一种结合NADES-USE与吸附纯化的环保、高效提取方法，用于苦橙花总黄酮的回收。ChCl-EG被确定为最佳提取溶剂，其提取效率显著高于传统溶剂。通过BBD优化，研究获得了104.58±0.34 mg/g的总黄酮提取量，是传统溶剂提取效率的1.30到2.16倍。AB-8树脂在吸附纯化中表现出最佳性能，其吸附过程符合Langmuir等温线和伪二级动力学模型。热力学分析表明，该吸附过程为自发、放热且熵减的过程。后续的柱层析纯化实现了75.62±0.95%的纯度。此外，研究开发了一种UPLC-Q/TOF-MS/MS方法，用于苦橙花总黄酮提取物的全面化学表征和七个主要活性黄酮的同步定量分析，为该提取物的质量评估提供了可靠平台。

未来的研究应进一步探讨该方法的工业化可行性，特别是在能耗和经济性方面。此外，对提取物的健康效益和安全性需通过体外和体内生物学实验进行验证。探索该纯化后的苦橙花总黄酮提取物在功能性食品或营养补充剂中的应用，有助于将实验室成果转化为实际应用。