依序布芬通过激活PI3K/Akt/eNOS通路减轻心肌缺血再灌注损伤的机制研究

《Scientific Reports》：Indobufen alleviates apoptosis by the PI3K/Akt/eNOS pathway in myocardial ischemia?reperfusion (I/R) injury

本研究针对心肌缺血再灌注（I/R）损伤缺乏有效干预措施的临床难题，系统探讨了抗血小板药物依序布芬（Indobufen）的心脏保护作用及分子机制。通过建立大鼠心肌I/R模型和H9c2细胞氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，研究人员发现依序布芬预处理能显著减小梗死面积、改善心功能、抑制氧化应激和心肌细胞凋亡。机制研究表明，该保护作用通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路实现，且可被PI3K抑制剂LY294002逆转。该研究为依序布芬拓展临床应用提供了重要的实验依据，为心肌梗死防治提供了新的潜在策略。

　　

当心脏血管突然堵塞导致心肌缺血时，及时恢复血流本是挽救生命的关键措施。然而，医学实践中发现一个令人困扰的现象：再灌注过程本身可能引发更严重的心肌损伤，这就是心肌缺血再灌注（I/R）损伤。这种损伤如同"双刃剑"，虽然恢复了血液供应，却可能通过氧化应激、钙超载、炎症反应和线粒体功能障碍等多种机制导致心肌细胞大量死亡。目前，针对I/R损伤的有效治疗手段仍然有限，开发能够调控这些病理过程的药物成为心血管领域的研究热点。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员将目光投向了一种临床常用的抗血小板药物——依序布芬。与传统抗血小板药物相比，依序布芬具有可逆性抑制血小板聚集、胃肠道副作用小等优势，但其在心肌保护方面的潜力尚未被充分探索。研究团队假设依序布芬可能通过调控细胞存活信号通路，发挥超越抗血小板作用的心脏保护效果。

为了验证这一设想，研究团队采用多层次实验方案：在体实验使用SD大鼠建立心肌I/R模型，离体实验采用H9c2心肌细胞构建OGD/R模型。实验动物被随机分为假手术组、模型组、依序布芬不同剂量组（20 mg/kg和10 mg/kg）以及阳性对照药氯吡格雷（7.5 mg/kg）和阿司匹林（10 mg/kg、5 mg/kg）组，药物预处理5天后实施手术。细胞实验则设置了对照组、OGD/R组、药物干预组及通路抑制剂联合用药组。

关键技术方法包括：通过TTC染色定量心肌梗死面积，超声心动图评估心功能指标（左室射血分数EF%和短轴缩短率FS%），生化试剂盒检测血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）水平，TUNEL染色和Western blot分析细胞凋亡情况，免疫组化、免疫荧光和Western blot检测PI3K/Akt/eNOS通路关键蛋白表达。

依序布芬减轻I/R大鼠心肌梗死和心肌组织病理损伤

通过TTC染色发现，I/R组大鼠心肌梗死面积显著增加，而依序布芬预处理能明显减小梗死范围。依序布芬20 mg/kg剂量的效果与氯吡格雷相当，均显著优于模型组。H&E染色结果显示，依序布芬预处理组心肌组织结构损伤明显减轻，炎细胞浸润、充血、出血和坏死细胞数量显著减少。

依序布芬改善I/R大鼠左心室功能

超声心动图分析显示，I/R组大鼠EF%和FS%显著降低，表明心功能严重受损。依序布芬预处理后，这两个关键心功能指标均得到明显改善，且20 mg/kg剂量组效果更为显著，证明依序布芬能有效保护I/R损伤后的心脏收缩功能。

依序布芬降低心肌损伤酶水平并缓解氧化应激损伤

I/R损伤导致血清中CK、LDH和MDA水平显著升高，SOD活性明显降低。依序布芬预处理能剂量依赖性地逆转这些变化，降低氧化应激损伤标志物，提升抗氧化酶活性。同时，依序布芬还显著降低了血浆中活性氧（ROS）水平，增加了eNOS含量和NO生成。

依序布芬抑制I/R损伤后心肌细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，I/R组心肌细胞凋亡显著增加，而依序布芬预处理能明显减少凋亡细胞比例。Western blot分析发现，依序布芬上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达，表明其通过调节凋亡相关蛋白发挥抗凋亡作用。

依序布芬激活PI3K/Akt/eNOS信号通路

免疫组化和Western blot结果一致显示，依序布芬能显著提高心肌组织中p-Akt和p-eNOS蛋白表达水平。在H9c2细胞实验中，依序布芬同样增加了p-Akt和p-eNOS的表达，且这一效应可被PI3K抑制剂LY294002完全逆转，证实PI3K/Akt/eNOS通路在依序布芬心脏保护作用中的关键地位。

依序布芬减轻OGD/R诱导的H9c2细胞损伤

细胞实验证实，依序布芬能显著提高OGD/R处理后H9c2细胞的存活率，改善细胞形态，降低培养上清中CK、LDH和MDA水平，升高SOD活性。这些保护作用同样被LY294002抑制，进一步验证了PI3K/Akt通路的核心作用。

依序布芬抑制OGD/R诱导的H9c2细胞凋亡

TUNEL染色和Western blot结果显示，依序布芬能显著减少OGD/R诱导的H9c2细胞凋亡，下调Caspase-3活性，调节Bcl-2/Bax蛋白表达平衡。这些效应也依赖于PI3K/Akt通路的激活。

依序布芬促进OGD/R H9c2细胞中p-Akt/p-eNOS表达

免疫荧光和Western blot分析表明，依序布芬能显著增强H9c2细胞中p-Akt和p-eNOS的表达，且这一作用可被LY294002阻断，从细胞水平证实了依序布芬对PI3K/Akt/eNOS通路的激活效应。

本研究首次系统阐明了依序布芬单药治疗对心肌I/R损伤的保护作用及分子机制。研究表明，依序布芬通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路，有效减轻氧化应激损伤，抑制心肌细胞凋亡，从而缩小梗死面积，改善心脏功能。这一发现不仅拓展了依序布芬的临床应用前景，为心肌梗死防治提供了新的药物选择，更重要的是揭示了抗血小板药物可能具有独立于抗凝作用的心脏保护机制。

研究结果具有重要的转化医学价值：一方面，依序布芬作为已上市药物，其安全性 profile 明确，临床推广应用障碍较小；另一方面，该研究为开发针对PI3K/Akt/eNOS通路的心肌保护剂提供了新的思路和靶点。尽管研究存在模型单一、观察时间较短等局限性，但为后续临床研究奠定了坚实的实验基础，有望为心肌梗死患者带来新的治疗希望。