STAT3的功能获得性变异与视网膜黄斑水肿：对视网膜色素上皮中IL-6 R/JAK/STAT3通路的深入理解

《Ocular Immunology and Inflammation》：Gain-of-Function Variant in STAT3 and Retinal Macular Edema: Insights into the IL-6?R/JAK/STAT3 Pathway in Retinal Pigment Epithelium

该研究探讨STAT3 p.L387R gain-of-function（GOF）变异体在非感染性葡萄膜炎相关黄斑水肿中的作用机制。通过体外实验发现，该变异体显著增强IL-6和IFN-α信号通路活性，导致RPE细胞分泌VEGF-A和IL-6水平升高，同时下调紧密连接蛋白CLDN11表达，破坏血视网膜屏障。JAK抑制剂可抑制SOCS3反馈通路，证明靶向IL-6R/JAK/STAT3轴对治疗此类黄斑水肿具有潜力。

　　本研究聚焦于STAT3的获得性功能增强（GOF）变异体p.L387R在非感染性葡萄膜炎相关黄斑水肿中的病理作用。通过分析一个携带该变异体的家族成员的临床表现和实验模型，研究揭示了STAT3在视网膜色素上皮细胞（RPE）中的异常激活如何影响血管通透性和黄斑水肿的形成，并探讨了JAK抑制剂在治疗此类疾病中的潜在应用。

黄斑水肿是一种在视网膜各层中出现液体积聚的病理现象，通常发生在中央视网膜或内核层、Henle纤维层以及视网膜下空间的囊状区域，从而破坏正常的视网膜结构。患者常表现出视觉障碍，如中央暗点、视力模糊、视物变形、小视症和对比度及色彩敏感度下降，若长期存在，可能导致不可逆的视力丧失，尤其是在黄斑区域积聚液体时。诊断依赖于全面的眼科检查，并结合光学相干断层扫描（OCT）量化黄斑厚度以及荧光素眼底血管造影（FFA）检测血管渗漏和揭示潜在的病理机制。黄斑水肿常伴随多种视网膜疾病，如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞和非感染性后葡萄膜炎，是这些疾病导致视力损伤的主要原因。

从分子层面来看，黄斑水肿的发生与血视网膜屏障（BRB）功能障碍密切相关。BRB由两层细胞结构组成：内层由视网膜毛细血管内皮细胞之间的紧密连接构成，外层则由视网膜色素上皮细胞及其下方的Bruch膜组成。紧密连接的破坏会扰乱视网膜和脉络膜循环之间的渗透压和静水压平衡，从而导致液体在视网膜中异常积聚。此外，屏障功能受损还会促进局部释放促血管活性介质，如血管内皮生长因子A（VEGF-A）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），这些介质在眼内液中可检测到，并直接参与内皮细胞激活和血管通透性的增加。值得注意的是，某些遗传性视网膜疾病即使在血管造影显示屏障完整的情况下，也可能出现黄斑水肿，这表明遗传因素和 Müller 细胞功能障碍在液体积聚中起重要作用。

治疗方面，一线疗法通常针对潜在的炎症或缺血性刺激，以减少视网膜厚度并改善视力。然而，许多情况下，辅助性的区域性皮质类固醇治疗（如眼周或玻璃体腔内注射）是实现快速且持续性水肿缓解的必要手段。对于难治性或慢性病例，玻璃体腔内抗VEGF药物已成为标准治疗方案。近年来，针对IL-6受体（IL-6R）的阻断剂，如托珠单抗（tocilizumab），作为一种潜在的治疗选择，因其能够抑制IL-6R/JAK1/2/STAT3信号通路而受到关注。托珠单抗已被证实在类风湿性关节炎、巨细胞动脉炎、与SARS-CoV-2相关的系统性炎症以及葡萄膜炎相关黄斑水肿中具有良好的疗效。Radosavljevi?等的研究指出，托珠单抗在大多数患有严重或难治性囊状黄斑水肿的非感染性葡萄膜炎患者中取得了良好的解剖和功能结果。即使在其他免疫调节治疗失败的情况下，托珠单抗也可以作为慢性葡萄膜炎相关黄斑水肿的治疗选择。此外，初步研究正在探索其在非葡萄膜炎相关黄斑水肿中的应用，例如与视网膜色素变性相关的病例。

从机制上讲，IL-6通过激活IL-6R/JAK/STAT3信号通路，在视网膜炎症和黄斑水肿的发展中扮演关键角色。该通路的激活涉及STAT3的磷酸化，随后以二聚体形式进入细胞核，结合DNA并调控一系列基因的转录。IL-6由先天免疫系统的多种细胞类型产生，与自身免疫性炎症疾病如非感染性葡萄膜炎的发生密切相关。这些机制包括促进T辅助细胞17（Th17）向调节性T细胞（Treg）的分化，从而导致促炎性细胞因子如TNF-α的表达增加。除了在葡萄膜炎和随后黄斑水肿形成中的作用外，IL-6还会通过下调视网膜内皮细胞中的紧密连接蛋白，损害内层血视网膜屏障，促进液体外渗。这种屏障的破坏是视网膜退化、黄斑水肿和进行性视力丧失的重要病理基础。此外，IL-6还能诱导血管内皮生长因子（VEGF）的产生，进一步增加血管通透性。IL-6还通过增加细胞间黏附分子1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）促进白细胞的招募，协助其黏附于血管内皮。

STAT3获得性功能增强综合征（GOF syndrome）是一种新近被认识的常染色体显性免疫缺陷（IEI），导致异质性的免疫失调。该综合征在儿童期即可显现，特征包括淋巴细胞增殖、自身免疫、自身炎症、肠病、炎症性皮肤病、肺部疾病、内分泌疾病和产后身材矮小。其他如神经系统疾病、血管病变、炎症性肝病和恶性肿瘤等也可能发生，但较为少见。STAT3-GOF综合征的异质性可能与STAT3在免疫细胞和非免疫细胞中的广泛表达有关。例如，产后身材矮小是由于STAT3-GOF变异体干扰生长激素（GH）受体信号分子STAT5b的功能。到目前为止，已有六名携带五个不同STAT3 GOF变异体（如p.K290N、p.N646K、p.K658N、p.P715L和T716M）的患者表现出眼部异常，包括角结膜炎、后葡萄膜炎伴囊状黄斑水肿、孤立性葡萄膜炎和色素性视网膜炎。我们在此研究中发现了一个携带STAT3 p.L387R变异体的家族，其中三名成员出现了严重的囊状黄斑水肿并伴有视网膜血管渗漏的证据。最近，研究人员构建了携带相同异质性STAT3 p.L376R变异体的小鼠模型，并观察到该变异体在小鼠中与一些眼部并发症（如先天性单侧无眼和后期出现的炎症性眼部病变）的发生率略高。携带p.L387R变异体的个体黄斑水肿可能反映了自身免疫性炎症和由过度活跃的STAT3驱动的细胞内生化失调。p.L387R变异体与显著的视网膜表型的共存提示了RPE细胞中表达该变异体可能分泌高水平的促血管生成和促炎性介质，这一概念得到了在葡萄膜炎相关黄斑水肿中使用IL-6R阻断剂（如托珠单抗）的临床疗效的支持。这种“自然实验”为研究STAT3在RPE细胞中的病理功能提供了独特的契机。为此，我们对携带不同STAT3变异体的RPE细胞进行了转录组分析，评估其转录组、细胞因子谱、促血管生成因子表达以及紧密连接的形成情况。

在临床表现方面，该家族中的一名47岁女性患者（II-2）自童年时期便出现多种健康问题，并在11岁时开始接受医学监测。她经历了反复的细菌性呼吸道感染，并伴有肺部并发症，如支气管扩张、胸膜纤维化和非感染性纵隔淋巴结（活检显示肉芽肿性炎症）。她还经历了反复的单纯疱疹病毒感染。在20岁时被诊断为抗体缺乏，需要接受静脉注射免疫球蛋白替代治疗。非感染性并发症包括难以控制的自身免疫性甲状腺功能减退和视力障碍。25岁以后，她出现了反复的肠道管状腺瘤，25至37岁期间接受了12次息肉切除手术。她还患有系统性肉芽肿性淋巴结病、肉芽肿性乳腺炎症和三次自发流产。遗传分析显示，该患者携带一个位于STAT3基因DNA结合域（DBD）的非功能性杂合变异体，即c.1160 T > G，p.(Leu387Arg)，这一变异体已被最近报道。功能研究表明，该变异体导致STAT3蛋白的获得性功能增强。她的22岁女儿（III-2）在新生儿期出现低血糖，也经历了反复的肺部细菌感染，并表现出与母亲相似但较轻的视网膜病变。免疫学检查发现她存在IgG2亚类缺乏，并携带相同的STAT3杂合变异体。II-2的兄弟（II-3）同样携带该变异体，其生长激素-胰岛素样生长因子1（IGF-1）轴功能受损，导致IGF-1缺乏，并被诊断为常见变异型免疫缺陷（CVID）。另外两名家族成员因未能进行基因检测而面临致命的健康问题：一名死于难治性非霍奇金淋巴瘤伴低γ球蛋白血症（II-4），另一名患有1型糖尿病并死于真菌性脑炎（II-6）。本研究中所见的详细临床表现见补充表S1，并与一项关于191名STAT3 GOF综合征患者的最新研究中描述的临床特征基本一致，涵盖72种不同的STAT3变异体。

在该家族中，携带STAT3 p.L387R变异体的患者表现出显著的视网膜病变，包括反复的视网膜炎、新生血管形成、视网膜水肿和视乳头水肿。这些初始观察结果曾在之前的研究中被报道。患者的视网膜病变通过醋酸唑胺、系统性皮质类固醇、奥曲肽、玻璃体腔内抗VEGF注射以及局部皮质类固醇治疗。然而，由于反复感染（如肺部感染和带状疱疹），抗IL-6治疗（如托珠单抗）被多次中断。目前，该患者正在服用低剂量托法替丁（5 mg/天）和伐昔洛韦以预防疱疹感染。患者的眼部缺陷、眼底检查和视力情况见表1和图1a–c。

在细胞水平上，我们发现携带STAT3 p.L387R变异体的RPE细胞表现出显著的获得性功能增强表型。为此，我们首先研究了在STAT3转导的OZR-1细胞中，干扰素α（IFN-α）和IL-6刺激后的反应。OZR-1细胞是从角膜移植供体眼中建立的原代RPE细胞系，并在RPE培养基中生长。我们使用了之前详细表征的相同OZR-1细胞株，这些细胞保留了与ARPE-19和诱导性多能干细胞（iPSC）来源的RPE细胞相似的RPE特征，包括高水平的RPE65、BEST1、MITF和CRALBP表达，紧密连接蛋白的稳健定位，以及跨上皮电阻超过150 Ω·cm。在我们的实验中，我们包括了STAT3野生型（WT）和来自无视网膜病变家族的STAT3 p.Y360C变异体。此外，在每次实验前，我们通过流式细胞术确认了所有组中总STAT3表达水平相似（补充图S1b）。之前的研究显示，携带STAT3 p.L387R变异体的细胞对IFN-α表现出非常活跃的反应。在OZR-1细胞中，表达两种STAT3-GOF变异体的细胞显示出显著的磷酸化STAT3（Tyr705）表达，尤其是携带p.L387R变异体的细胞，与WT组相比（图2a）。在不同组别中，STAT3的基线表达水平保持一致（图2a）。抑制细胞因子信号的3（SOCS3）是STAT3下游的靶基因之一，并在STAT3激活的负反馈回路中起抑制作用。SOCS3的表达水平反映了STAT3的活性。我们发现，在IL-6刺激2小时或IFN-α刺激4小时后，携带STAT3 p.L387R变异体的OZR-1细胞中SOCS3的表达水平显著高于其他组（图2b，**** = p ≤ 0.0001）。这表明在IFN-α刺激下，STAT3 p.L387R变异体引发的负反馈反应远强于STAT3 WT或p.Y360C变异体，导致携带p.L387R变异体的OZR-1细胞表现出更活跃的GOF表型。为确保不同STAT3变异体转导组之间观察到的效应真正反映变异体特异性活动而非克隆变异，在每次实验前，我们通过测量SOCS3诱导和细胞内STAT3水平来验证STAT3的GOF活动。只有那些STAT3水平相似且SOCS3显著上调的细胞批次才用于进一步的实验。值得注意的是，对于携带p.Y360C变异体的细胞，IFN-α和IL-6的最佳刺激时间分别为2小时和4小时（补充图S1c）。

此外，研究还发现，在IL-6刺激下，携带STAT3 GOF变异体的OZR-1细胞中，VEGF-A的mRNA水平显著升高，其中p.L387R组的升高最为显著（图4a–d）。在IL-6刺激后，蛋白检测也证实了p.L387R组中VEGF-A分泌水平显著高于其他组（图4c）。同时，IL-6分泌水平在p.L387R组中显著升高（图4d），进一步支持了该变异体引发的增强性炎症表型。这些显著的VEGF-A和IL-6分泌可能破坏紧密连接的完整性，导致携带STAT3 p.L387R变异体的原代RPE细胞膜通透性增加和屏障功能受损，进而激活视网膜内皮细胞（REC）。

在紧密连接蛋白表达方面，研究发现，携带STAT3 GOF变异体的细胞在IFN-α刺激后，对claudin-1的mRNA表达表现出显著的下调，尽管这种下调与WT组相似（补充图S1d，左图）。OCLN1的mRNA表达也略有下降，但与WT组无显著差异（补充图S1d，中图）。TJP1的表达则未受IFN-α刺激的影响，各组之间没有显著差异（补充图S1d，右图）。这些结果表明，STAT3的活动可能轻微调节原代RPE细胞中紧密连接相关基因的表达。

通过转录组分析，我们进一步揭示了STAT3-WT和STAT3 p.L387R转导的原代RPE细胞在基因表达上的差异。在基础条件（未刺激）下，火山图（图5a，左图）显示，只有57个基因（尤其是UCHL1，泛素羧基末端水解酶L1）在STAT3 p.L387R与STAT3 WT转导的细胞之间表现出显著差异。相比之下，在IFN-α刺激下（图5a，右图），STAT3 p.L387R变异体引发的基因表达变化更为广泛，有621个基因表现出显著上调，而仅有少数基因下调。这表明，p.L387R变异体在IFN-α刺激下对下游靶基因的诱导作用远强于WT蛋白。这些基因包括与细胞-细胞粘附、紧密连接调节和血管生成相关的基因。功能富集分析进一步显示，携带p.L387R变异体的细胞与对照组（EV和STAT3-WT）相比，显著富集了与上皮-间质转化（EMT）相关的通路，包括“HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION”信号，以及与间质发育相关的功能类别。此外，血管生成相关的通路如“血管形成”也在p.L387R组中被显著富集（图5b）。与细胞迁移和侵袭相关的功能类别在IFN-α刺激下的p.L387R组中高度富集，提示该变异体可能通过不同的机制促进细胞迁移和血管生成。

在信号通路调控方面，上游调节器分析进一步识别了IL-6、TGF-β和VEGF相关通路等关键信号分子和转录因子，它们在p.L387R组中被显著激活，可能是其在视网膜病变中发挥作用的机制之一。在RPE细胞中，这些通路的激活可能通过促进促炎性细胞因子和促血管生成因子的表达，进一步损害血视网膜屏障的完整性，导致液体积聚和水肿。

在实验模型中，我们发现STAT3-L387R转导的原代RPE细胞对IL-6和IFN-α刺激表现出显著的基因表达变化。具体而言，携带该变异体的细胞在刺激后分泌的IL-6和VEGF-A水平显著高于野生型和p.Y360C变异体，而IL-6R和IL-6ST（GP130）的表达则未受影响。STAT3激活的动力学在不同变异体之间存在显著差异，每个构建体在IL-6或IFN-α刺激后达到SOCS3诱导峰值的时间点不同（补充图S1c）。在p.Y360C变异体中观察到的最小效应与该时间点的SOCS3表达水平较低相符。

VEGF-A是黄斑水肿中血管通透性的主要驱动因子。VEGF-A通过诱导紧密连接蛋白（如occludin和TJP1）的快速磷酸化和内化，破坏内皮屏障的完整性，导致细胞间漏出。事实上，VEGF-A在体外可以增加牛视网膜内皮细胞单层的通透性，并是多种眼病中病理性血管变化的主要介质。另一方面，VEGF-A也可能通过不明显的连接蛋白解聚机制促进液体渗漏，如在猕猴中进行的玻璃体腔内VEGF注射实验显示，尽管紧密连接保持完整，但血管通透性却显著增加。

尽管抗VEGF疗法在治疗黄斑水肿方面显示出良好的效果，但体外研究表明，VEGF本身或其抑制剂对RPE细胞的紧密连接完整性影响有限，提示存在其他机制驱动屏障功能的破坏。临床观察表明，玻璃体腔内VEGF和IL-6的浓度与水肿严重程度和非灌注视网膜区域的大小密切相关。此外，促炎性细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α通常与VEGF在囊状病变中共同升高，并被证实参与血视网膜屏障的破坏，进一步强调了它们在水肿发生中的协同作用。

在本研究中，携带STAT3-L387R变异体的原代RPE细胞的细胞因子和促血管生成谱型为患者中观察到的严重血管渗漏提供了分子机制解释。这些细胞分泌高水平的IL-6、VEGF-A（图4a–d）和CCL2（图6c–d），而这些因子的过度表达可能通过破坏紧密连接和促进炎症反应，进一步损害血视网膜屏障功能。此外，CCL2（C-C趋化因子配体2）通过招募单核细胞、记忆T细胞和树突状细胞，可能在炎症区域引发多种促炎性细胞因子的产生。值得注意的是，缺乏CCL2或其受体CCR2的小鼠表现出与年龄相关的RPE和视网膜光感受器退化，这表明CCL2在维持视网膜稳态中具有重要作用。VEGF-A和IL-6可能通过直接作用于内皮细胞，导致紧密连接蛋白的磷酸化和内化，从而增加内皮细胞通透性和白细胞黏附。这些综合作用可能解释了携带STAT3-L387R变异体的患者中观察到的广泛血视网膜屏障破坏和黄斑水肿的发生。

在RNA测序中，我们发现STAT3-L387R与WT OZR-1细胞相比，UCHL1的表达被显著下调。UCHL1编码一种去泛素化酶，负责从靶蛋白（如表皮生长因子受体EGFR）中移除泛素，从而调节其稳定性和降解。UCHL1在多种肺癌中过表达，提示其可能在细胞稳态调节中具有重要作用。UCHL1的减少可能导致EGFR信号持续激活，进而引发一系列促炎性介质和增加血管通透性的因子的异常表达。在视网膜微环境中，增强的通透性和炎症可能破坏RPE屏障，导致液体积聚和水肿。晚期糖基化终产物（AGEs）在RPE基底膜的积累已被证实会改变RPE蛋白稳态。许多蛋白质在这一RPE衰老模型中发生改变，包括UCHL1，这可能影响RPE的降解能力。AGEs在Bruch膜的积累可能在年龄相关性RPE功能障碍中起重要作用，并可能与年龄相关性黄斑变性的进展有关。UCHL1在衰老或AGE暴露的RPE中的增加可能反映了蛋白降解机制的补偿性反应或压力。因此，UCHL1表达的降低可能加剧这些压力，削弱屏障的完整性。此外，AGEs还能增强RPE细胞对TNFα的反应。

对于携带STAT3-GOF综合征的患者，目前常用JAK抑制剂如巴瑞替尼（baricitinib）和鲁索替尼（ruxolitinib）来调节IL-6R/JAK/STAT3信号通路。我们评估了这些抑制剂对携带STAT3-L387R变异体的OZR-1细胞中SOCS3表达的影响。结果显示，两种抑制剂均显示出减少SOCS3表达的趋势，尤其是在携带高度活跃的STAT3-L387R变异体的细胞中（图7a,b）。这些数据支持JAK抑制剂在治疗STAT3-GOF相关眼部炎症和非感染性葡萄膜炎中的潜在应用。然而，临床数据表明，仅有一位患者曾接受托法替丁（tofacitinib）以防止视力丧失，但反复的呼吸道和疱疹感染中断了治疗，导致其视力持续下降，即使在尝试控制血管炎、玻璃体炎和黄斑水肿方面也未能有效改善。目前，针对葡萄膜炎相关黄斑水肿的JAK抑制剂的临床数据仍然有限。

我们提出的假设模型（图8）说明了STAT3-GOF p.L387R变异体如何通过RPE细胞驱动视网膜病变。整合患者的临床数据、细胞因子激活研究和转录组分析，我们推测p.L387R变异体在RPE细胞中导致IL-6R/JAK/STAT3通路的过度激活，进而引发促炎性细胞因子和促血管生成因子（如IL-6、VEGF-A和CCL2）的表达升高，并显著激活SOCS3的负反馈反应。同时，该变异体与紧密连接蛋白（如CLDN11）和蛋白稳态相关基因（如UCHL1）的下调相关，这可能削弱屏障功能。这些分子变化可能共同导致组织重塑、血管通透性增加以及受影响患者中观察到的黄斑水肿。尽管p.Y360C变异体同样位于DNA结合域，但并未引发类似的改变，这表明不同变异体可能通过不同的机制影响反馈调控。此外，其他与葡萄膜炎或黄斑水肿相关的STAT3-GOF变异体位于不同的结构域，提示存在多种变异体依赖的通路，最终导致眼部屏障的破坏。

未来的研究应直接评估携带p.L387R变异体的OZR-1细胞条件培养基对REC屏障完整性、连接蛋白表达和血管功能的影响，无论是体外还是体内实验。这类研究将有助于明确RPE与REC之间的相互作用机制，并加强针对IL-6R/JAK/STAT3轴的治疗策略在STAT3-GOF相关眼部炎症和非感染性葡萄膜炎中的应用依据。