CD4适配体工程化细胞平台通过增强MHC II抗肿瘤免疫抑制三阴性乳腺癌生长

《Cell Biomaterials》：CD4 aptamer-engineered cell platforms enhance anti-tumor immunity in triple-negative breast cancer

本研究针对当前免疫疗法对CD8+T细胞过度依赖且对MHC I缺陷肿瘤疗效有限的困境，开发了CD4适配体工程化的液氮处理癌细胞平台(AptCD4-LNTs)。该平台通过CD4适配体特异性捕获激活CD4+T细胞，并利用LNTs的肿瘤归巢能力实现靶向递送，显著增强TNBC肿瘤内CD4+T细胞浸润和活化。研究发现激活的CD4+T细胞通过MHC II免疫应答重塑肿瘤微环境，招募B细胞、DC细胞和NK细胞协同发挥抗肿瘤作用，为TNBC免疫治疗提供新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CD8⁺T细胞长期以来被视为抗肿瘤的主力军。然而，随着研究深入，科学家们发现这种过度依赖存在明显局限：一方面，CD8⁺T细胞在免疫抑制性肿瘤微环境中容易耗竭；另一方面，部分肿瘤通过下调主要组织相容性复合体I类分子(MHC I)来逃避免疫识别。这些机制导致相当比例的患者无法从现有免疫疗法中获益。

面对这一挑战，CD4⁺T细胞逐渐展现出其独特价值。这类细胞不仅能够辅助CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)发挥作用，某些亚群还能直接杀伤表达MHC II的肿瘤细胞。在胶质母细胞瘤、黑色素瘤和HER2⁺乳腺癌等多种肿瘤模型中，CD4⁺T细胞甚至显示出优于CD8⁺T细胞的抑瘤效果。然而，如何让CD4⁺T细胞有效浸润肿瘤并克服免疫抑制环境，成为实现其治疗潜力的关键瓶颈。

针对这一难题，Heming Tang、Yalin Xiong等研究人员在《Cell Biomaterials》上发表了创新性研究成果。他们巧妙地将CD4特异性适配体与液氮处理的癌细胞相结合，构建了AptCD4-LNTs平台，成功实现了CD4⁺T细胞在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤内的特异性招募和激活。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过代谢糖标记和点击化学构建适配体-细胞缀合物；利用流式细胞术和共聚焦显微镜验证靶向特异性；建立小鼠TNBC模型进行体内疗效评估；采用单细胞RNA测序分析肿瘤免疫微环境变化；通过细胞因子检测和抗体阻断实验验证作用机制。

设计并制备AptCD4-LNTs

研究人员首先筛选出特异性结合CD4的适配体AptCD4，通过流式细胞术和共聚焦显微镜验证了其对小鼠和人类CD4⁺T细胞的特异性识别能力。随后，他们利用代谢糖标记技术在4T1细胞表面引入叠氮修饰，通过液氮快速冷冻制备保持细胞结构的LNTs。优化后的M3-F条件（胎牛血清作为冷冻保护剂，液氮快速冷冻）确保了LNTs既无增殖活性又保持结构完整。最后通过点击化学反应将DBCO修饰的CD4适配体与N3-LNTs缀合，成功构建AptCD4-LNTs系统。稳定性实验表明，缀合形式显著提高了适配体的血液循环稳定性，且体内实验证实其无致瘤性。

AptCD4-LNTs促进CD4⁺T细胞浸润

研究团队通过体外Transwell实验和体内活体成像技术，证实4T1来源的AptCD4-LNTs具有显著的肿瘤归巢能力。这种特性与肿瘤细胞表面表达的IL-6R和Fascin-1分子密切相关。在TNBC荷瘤小鼠模型中，静脉注射的AptCD4-LNTs能特异性富集于肿瘤部位，并持续存在超过264小时。更重要的是，通过流式细胞术和多重免疫荧光染色发现，AptCD4-LNTs处理组肿瘤内CD4⁺T细胞浸润显著增加，尤其在肿瘤边缘区域呈现明显富集。值得注意的是，虽然调节性T细胞(Treg)也有轻微增加，但其在CD4⁺T细胞群体中占比很小，不影响整体效应功能。

AptCD4-LNTs抑制肿瘤生长

在治疗效果评估中，AptCD4-LNTs治疗组显示出最强的肿瘤生长抑制效果，与未处理组、LNT组和Aptcontrol-LNT组相比，第18天时肿瘤体积分别减少3.9倍、3.4倍和2.4倍。生存分析进一步表明，AptCD4-LNTs能显著延长荷瘤小鼠的生存期。此外，该治疗还减少了4T1肿瘤的肺转移发生率，且未引起明显体重下降或主要器官损伤，显示出良好的安全性。

AptCD4-LNTs选择性动员CD4⁺T细胞

单细胞RNA测序分析揭示了AptCD4-LNTs的作用机制。结果显示，治疗后肿瘤内CD4⁺T细胞在CD3⁺T细胞中的比例增加2.6倍，CD4⁺/CD8⁺T细胞比值提高4.3倍。这些CD4⁺T细胞高表达CD69、ICOS、CD28等共刺激分子，处于高度活化状态。体外实验证实，AptCD4-LNTs能以剂量依赖方式激活CD4⁺T细胞，并促进IL-2、TNF-α和IFN-γ等效应细胞因子的分泌。通过抗MHC II抗体阻断实验，研究人员进一步证实79.2%的抗肿瘤效果依赖于MHC II抗原呈递通路。

CD4⁺T细胞重塑TNBC肿瘤微环境

深入机制研究发现，激活的CD4⁺T细胞并非通过直接细胞毒性作用抑制肿瘤。单细胞测序数据显示，CD4⁺T细胞与肿瘤细胞间的相互作用反而减少，且细胞毒性相关基因表达下调。相反，AptCD4-LNTs处理显著增强了CD4⁺T细胞与B细胞、DC细胞和NK细胞间的通讯网络，促进了这些免疫细胞的肿瘤浸润和活化。具体表现为细胞毒性NK细胞（高表达GZMA和PRE1）比例增加，成熟DC细胞（表达CD80、CD86、CD40等）和活化B细胞数量上升，共同构成了协同抗肿瘤的免疫环境。

该研究成功开发了一种新型细胞工程平台，通过协同利用CD4适配体的特异性靶向能力和LNTs的肿瘤归巢特性，实现了CD4⁺T细胞在TNBC肿瘤内的精准招募和激活。研究不仅证实了CD4⁺T细胞独立于CD8⁺T细胞的抗肿瘤能力，还阐明了其通过重塑肿瘤免疫微环境、增强MHC II免疫应答的作用机制。这一策略为克服当前免疫疗法对MHC I缺陷肿瘤的局限性提供了新思路，为TNBC及其他"冷"肿瘤的免疫治疗开辟了新途径。未来通过优化LNTs归巢能力、联合检查点抑制剂等策略，有望进一步拓展该平台的临床应用前景。