基于胺交联剂介导的无酶化学DNA连接技术用于miRNA检测的新策略

《Cell Reports Physical Science》：Enzyme-free chemical DNA ligation via amine-crosslinker-mediated DNA assembly for miRNA detection

本研究针对传统miRNA检测方法依赖温度敏感性酶、存在批次变异性和冷链存储需求等问题，开发了基于BS3介导的胺交联和CuAAC点击化学的无酶化学DNA连接平台。该技术可在宽温度范围内操作，保持11.4 ?的固定链间距，且与qPCR工作流完全兼容，为miRNA检测提供了更稳定、便捷的替代方案。

　　

在精准医疗时代，微小核糖核酸（miRNA）作为疾病诊断的关键生物标志物备受关注。这些长度仅18-24个核苷酸的小分子RNA，在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等重大疾病中表现出特异性的表达模式，成为液体活检和早期诊断的理想靶标。然而，当前miRNA检测的"金标准"——定量逆转录PCR（RT-qPCR）技术，却面临着难以逾越的技术瓶颈：其依赖的温度敏感性酶不仅引入批次间变异，还要求严格的低温存储条件，大大限制了在资源有限环境下的应用。

传统酶依赖性方法犹如"娇贵的艺术家"，对反应条件极为挑剔。逆转录酶和连接酶等关键酶制剂不仅需要复杂的缓冲体系，还容易受到样本中污染物的抑制，导致检测结果不稳定。更棘手的是，低温存储和运输要求的"冷链枷锁"，使得这些检测技术在偏远地区或现场检测场景中难以施展拳脚。正是认识到这些根本性限制，来自仁川大学和韩国生物科学与生物技术研究所的研究团队开始探索一条全新的技术路径——完全摆脱酶依赖的miRNA检测策略。

研究人员将目光投向化学连接领域，开发了两种创新的无酶DNA连接策略：胺-胺交联（使用BS³交联剂）和铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）点击化学。这两种方法各具特色：BS³介导的连接无需金属催化剂，在7-9的pH范围内表现出良好耐受性，并能维持11.4 ?的固定链间距；而点击化学则以其高特异性和快速动力学著称。这两种化学连接平台的成功开发，标志着miRNA检测技术向更稳定、更可靠的方向迈出了关键一步。

该研究团队在《Cell Reports Physical Science》上发表的这项成果，不仅展示了化学连接技术在miRNA检测中的巨大潜力，更为分子诊断领域带来了革命性的新思路。通过消除对生物酶的依赖，这项技术为开发更稳健、更易用的诊断工具奠定了坚实基础。

关键技术方法包括：通过胺修饰和点击化学修饰的DNA末端功能化技术；基于splint DNA引导的化学连接策略；紫外-可见光谱（UV-Vis）热稳定性分析；定量PCR（qPCR）扩增效率评估；桑格测序验证连接准确性；使用植物miRNA（ptc-miR1444d和rgl-miR5578）和肝病相关miRNA122作为检测靶标。

化学DNA组装

研究人员首先设计了两种化学连接策略：BS³介导的胺-胺交联和CuAAC点击化学反应。通过在这些DNA末端引入相应的反应基团，并利用30 bp的splint DNA引导两条50 bp单链DNA的精确对齐，成功实现了无酶条件下的DNA连接。

凝胶电泳结果证实了100 bp连接产物的成功形成，表明两种化学方法均能有效实现DNA连接。特别值得注意的是，BS³分子作为双功能交联剂，其末端的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯基与DNA末端的氨基形成稳定的酰胺键，而点击化学则通过铜催化剂促进叠氮和炔基形成三唑环连接。

化学DNA连接与splint DNA

研究发现splint DNA在化学连接过程中起着至关重要的作用。在没有splint DNA的情况下，两种化学连接方法的效率均显著降低，几乎无法检测到连接产物。而引入splint DNA后，反应效率明显提升，特别是在高反应物浓度条件下（9.2 μmol），连接效果更加显著。

比较研究表明，BS³介导的连接系统在不同浓度条件下均表现出优于点击化学的连接效率，显示出更佳的反应动力学特性。这一发现为后续的miRNA检测应用提供了重要依据。

修饰DNA骨架的结构分析

通过分子建模软件对三种不同骨架结构进行比较分析，发现化学修饰引入了明显的骨架扩展。天然磷酸二酯骨架的氧-碳（O-C）原子间距为3.926 ?，点击化学修饰的DNA为5.815 ?，而胺-胺交联DNA的间距最大，达到7.966 ?。

这种结构差异与热稳定性分析结果相一致：扩展程度最大的胺-胺交联DNA表现出最高的热稳定性，而天然DNA骨架由于结构紧凑，热稳定性相对较低。这些发现表明，通过化学修饰可以有针对性地设计具有优化热稳定性的合成核酸。

化学修饰DNA的热稳定性分析

紫外-可见光谱分析揭示了化学修饰对DNA热稳定性的影响。点击化学修饰DNA的熔解温度（T_m）为76.2°C，胺-胺交联DNA的T_m为73.0°C，而未修饰的对照DNA显示出最高的热稳定性（T_m=77.2°C）。

尽管化学修饰略微降低了DNA的热稳定性，但所有修饰后的DNA结构仍保持足够的完整性，适用于下游应用。这一发现为化学修饰DNA在实际应用中的可行性提供了重要支持。

化学连接DNA的定量PCR分析

qPCR分析进一步验证了化学连接DNA的质量和功能。标准曲线显示出优异的线性（R²> 0.99），表明定量过程的可靠性。扩增曲线显示，胺-胺连接DNA的阈值周期（C_t值）早于点击化学修饰DNA，表明其具有更高的反应效率或初始模板丰度。

熔解曲线分析显示，胺-胺修饰DNA的T_m为82.0°C，点击化学修饰DNA为81.9°C，这一结果与之前的结构分析一致，进一步证实了共价交联对DNA双链稳定性的增强作用。

化学连接DNA的序列分析

桑格测序分析验证了化学连接DNA的准确性和完整性。点击化学修饰DNA在化学连接位点附近偶尔观察到轻微的碱基缺失，而胺-胺交联DNA显示出更高的序列保真度，反映了共价连接赋予的增强结构稳定性。

对照DNA序列表现出高保真度，确认了修饰DNA中观察到的序列偏差确实源于化学修饰而非实验伪影。Q值分析进一步支持了测序数据的高可靠性。

通过无酶化学DNA连接进行miRNA检测

最重要的是，研究人员成功将该化学连接方法应用于miRNA检测，使用目标RNA替代splint DNA。胺基化学DNA连接在温度等广泛条件下表现出高反应稳定性，仅需添加BS³分子即可快速完成反应。

研究证实，miRNA能有效作为连接splint，与splint DNA功能相似。特别是在室温条件下使用肝病相关miRNA122和非互补30 bp splint DNA的实验，证明了该方法的高特异性。此外，研究还成功检测了植物miRNA，包括来自毛果杨的ptc-miR1444d和来自地黄的rgl-miR5578，进一步验证了该方法在不同靶序列中的适用性。

研究结论与意义

这项研究开发的酶游离化学DNA连接平台代表了miRNA检测技术的重要进步。与传统酶依赖性方法相比，该技术具有多重优势：消除了低温存储需求，显著降低了基础设施成本；避免了酶批间变异，确保了不同实验室和时间点的一致性性能；简化反应条件降低技术要求和成本；对样本污染物具有更好的耐受性。

特别值得关注的是，BS³介导的方法在宽温度范围内（4°C至37°C）均能可靠运行，无需精确温度控制，且保持固定的11.4 ?链间距，确保了结构可预测性。这两种化学方法均与下游PCR扩增完全兼容，可实现与现有qPCR工作流程的无缝整合。

然而，研究也指出了若干需要进一步优化的局限性：化学连接目前需要较长的反应时间和仔细的条件优化才能达到高产量；CuAAC点击反应需要铜催化剂，在生物环境中可能产生不利影响；引入非天然接头可能略微降低双链熔解稳定性和PCR扩增效率。

未来研究应着重优化化学修饰策略以最小化序列扰动，扩展验证范围以涵盖更广泛的临床相关miRNA，开发用于床旁应用的集成便携式检测平台，以及建立酶游离miRNA检测系统常规临床应用的标准化方案。这项技术为分子诊断领域提供了更稳定、更可靠的替代方案，特别是在资源有限或分散检测环境中具有重要应用前景。