Tankyrases通过I型干扰素反应正向调节甲型流感病毒的复制

《Journal of Virology》：Tankyrases positively regulate influenza A virus replication via type I interferon response

流感病毒依赖宿主Tankyrase 1/2（PARP5a/5b）促进复制，其敲除通过激活干扰素信号抑制病毒。CRISPR筛选显示Tankyrase是主要促病毒因子，双敲除显著降低病毒滴度并增强IFN-β表达及JNK/c-Jun通路。小鼠模型证实Tankyrase缺失保护动物免于致命感染。分隔符：

　　流感病毒是一种呼吸道病原体，它会导致人类的季节性感染以及不可预测的流行性感染。目前批准的抗流感药物主要针对病毒蛋白发挥作用。然而，流感病毒基因组中反复出现的突变可能导致药物耐受性，从而削弱抗流感药物的疗效。流感A病毒（IAV）依赖宿主因子完成其病毒生命周期，因此，越来越多的研究关注于针对宿主细胞蛋白的抗病毒药物开发。聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs）是宿主因子，通过在目标蛋白上添加ADP-核糖来调节蛋白功能。利用CRISPR激活系统，我们筛选了所有17个PARP成员对IAV感染的影响，并发现Tankyrase 1和2（TNKS 1/2或PARP5A/5B）是有效的促病毒因子。通过CRISPR技术在HEK293T细胞中敲除TNKS1或TNKS2可显著降低病毒mRNA和蛋白水平以及培养基中的病毒滴度。双敲除TNKS1和TNKS2对IAV感染的影响比单个等位基因敲除更为显著。TNKS双敲除对IAV复制的影响与病毒株无关。在双敲除细胞中过表达TNKS1/2可以恢复IAV复制水平至与对照细胞相似的程度。TNKS双敲除激活了JNK/c-Jun信号通路，增强了Stat信号通路，并增加了I型干扰素的表达。最后，敲除TNKS1或TNKS2的小鼠在感染IAV后，肺部病毒载量降低，生存率显著提高。这些结果表明，TNKS1和TNKS2通过I型干扰素反应调节流感病毒的感染。

PARPs在DNA修复、细胞应激反应、表观遗传学、基因转录和病原体感染中起着至关重要的作用。然而，PARPs在流感A病毒（IAV）感染中的具体作用尚不明确。在本研究中，我们发现Tankyrase 1和2（TNKS1/2或PARP5a/5b）是重要的促病毒因子。在人类细胞中敲除TNKS1或TNKS2可抑制IAV复制，而双敲除则显示出更大的抑制效果。TNKS双敲除还显著增强了IAV感染的I型干扰素反应。在体内实验中，TNKS1或TNKS2敲除小鼠在IAV感染后肺部病毒载量降低，生存率提高。这些发现表明，TNKS1和TNKS2是IAV感染的重要调节因子，具有作为抗病毒治疗靶点的潜力。

流感是一种通过呼吸道传播的传染病，通常会引起轻度感染，局限于上呼吸道。然而，严重的流感感染可能扩散到下呼吸道，并常伴随细菌二次感染，导致肺炎和急性呼吸衰竭。全球流感感染具有年度季节性流行和不可预测的流行性特征。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的估计，从2010到2020年间，流感病毒感染在美国造成了931万至4100万例疾病，430万至2100万次医疗访问，14万至71万例住院，以及1.2万至52万例死亡。年龄是流感感染的风险因素，特别是非常年幼（<1岁）和老年人（>65岁）更容易感染病毒。其他风险因素，如慢性肺部和心脏疾病、极端肥胖和怀孕，也可能导致高死亡率。

流感病毒基因组由八段负链单链病毒RNA组成，编码至少11种病毒蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白1（M1）、基质蛋白2（M2）、核蛋白（NP）、异三聚体RNA依赖性RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）、非结构蛋白1（NS1）、非结构蛋白2（NS2）以及辅助蛋白PB1-F2。NP、PA、PB1和PB2形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合物，与病毒RNA结合，为病毒复制提供必要的信息。

流感病毒的主要感染部位是人类的呼吸道，其中HA蛋白通过与上皮细胞上的唾液酸受体结合，启动感染过程。结合后，病毒颗粒通过内吞作用进入细胞，随后脱壳并释放vRNP进入细胞质。vRNP随后被转运至细胞核，病毒复制在此发生。新合成的病毒mRNA被转运至细胞质并翻译成病毒蛋白。之后，新合成的vRNP和病毒蛋白被组装成新的病毒颗粒，并从细胞膜释放，完成病毒生命周期。

PARPs是一类在细菌到人类中均存在的酶，它们通过将ADP-核糖添加到目标蛋白上，调控蛋白功能。人类基因组编码了17种PARPs，其中五种能够催化多聚ADP-核糖化，10种催化单聚ADP-核糖化，还有两种催化活性缺失。所有PARPs都具有一个催化域，称为PARP域。一些PARPs还含有其他结构域，如锚蛋白重复域、无菌α结构域（SAM）和宏结构域，这些结构域对于底物结合和寡聚化至关重要。

ADP-核糖化在DNA修复、细胞应激反应、细胞分化、能量代谢、表观遗传学、基因转录、信号传导途径和病原体感染中起重要作用。PARPs对病毒复制的调控作用，如冠状病毒、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、寨卡病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类巨细胞病毒（HCMV）和流感病毒，已有报道。PARPs既可以作为促病毒因子，也可以作为抗病毒因子。例如，PARP13（ZAPL）参与流感病毒PA和PB1蛋白的ADP-核糖化，这些蛋白随后被泛素-蛋白酶体途径降解。PARP1作为促病毒因子，通过促进病毒NP的高效合成或降解宿主I型干扰素受体，促进流感病毒复制。

干扰素（IFNs）是流感病毒必须克服的第一道屏障，以建立感染。I型干扰素如IFNα和IFNβ在先天性和适应性免疫中起主要作用。通过I型干扰素-Janus激酶（JAK）-信号转导子和转录激活子（STAT）通路激活抗病毒干扰素刺激基因（ISG）的转录，是限制病毒复制的关键事件。PARPs（PARP7、PARP10、PARP12L和PARP14）已被鉴定为干扰素刺激基因（ISGs），这些基因对病毒感染具有显著的抑制作用。例如，PARP7、PARP10和PARP12L显著抑制委内瑞拉马脑炎病毒和其他甲型病毒的复制。此外，当被干扰素信号激活时，PARP12有效防止寨卡病毒的复制。此外，PARP14已被确认为在冠状病毒感染期间调节I型干扰素产生的关键因子。因此，PARPs可能通过作为ISG或I型干扰素刺激因子来发挥其抗病毒活性。

Tankyrase 1（TNKS1）和Tankyrase 2（TNKS2），也称为PARP5A和PARP5B，在人类和小鼠之间高度保守，它们在染色体上具有相似的序列同源性，这表明它们在哺乳动物中的PARP基因家族中是真正的同源基因。这两个蛋白都含有三个保守的结构域：锚蛋白重复域，用于蛋白质-蛋白质相互作用；无菌α结构域（SAM），可能调节寡聚化；以及羧基末端的PARP催化域，负责多聚ADP-核糖化活性。TNKS1还含有额外的组氨酸-脯氨酸-丝氨酸（HPS）丰富的结构域。锚蛋白结构域为多种蛋白质结合伙伴提供了平台，导致广泛的生物学活动。TNKS1和TNKS2在细胞核和细胞质中均存在，并且在多种人类组织中广泛表达。

TNKS参与许多生物学过程，如DNA修复、端粒长度调控、癌症进展、肺纤维化和髓鞘形成。一些研究表明，TNKS在病毒的复制和致病性中起作用，如人类巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和单纯疱疹病毒。我们之前的研究表明，miR-9-1和miR-206通过靶向TNKS1和TNKS2来限制流感病毒复制。TNKS1或TNKS2敲除小鼠没有明显的表型，而双敲除会导致胚胎致死，这表明这两个等位基因之间存在功能冗余。

在本研究中，我们使用CRISPR激活筛选了人类PARP家族成员对流感A病毒（IAV）感染的影响，并发现TNKS1和TNKS2是强有力的促病毒因子。进一步的研究表明，敲除TNKS1或TNKS2可显著抑制IAV复制，而双敲除则显示出更大的抑制效果。TNKS双敲除还显著增强了I型干扰素反应。此外，TNKS1或TNKS2敲除小鼠在IAV感染后显示出更高的生存率和更低的病毒载量。

为了进一步研究TNKS对IAV感染的影响，我们通过CRISPR技术在HEK293细胞中建立了TNKS1、TNKS2和双敲除（DKO）细胞系。我们确认了这些细胞中TNKS1和TNKS2蛋白的缺失，并发现它们的缺失显著增加了Axin1蛋白的表达。细胞活力的测定显示，TNKS单敲除和双敲除细胞在感染前后均无显著差异，表明TNKS的缺失不会影响细胞活力。

接下来，我们使用平板法检测了TNKS1、TNKS2和DKO细胞感染IAV后的病毒生长动力学。从24小时后开始，所有三个TNKS敲除细胞的病毒滴度均显著低于野生型（WT）细胞，其中DKO细胞的病毒滴度下降最为显著。TNKS1敲除细胞中病毒NP和NS1蛋白水平在48小时后分别减少了26%和38%。TNKS2敲除细胞中NP和NS1蛋白水平也有所下降，但未达到显著水平。DKO细胞中NP和NS1蛋白水平的下降幅度更大，分别减少了67%和90%。这些效应也观察到了病毒NP mRNA表达的减少。

我们还使用了IAV诱导的报告基因检测系统来研究TNKS敲除对不同IAV株感染的影响。TNKS敲除细胞对H1N1 A/PR/8/34、A/Oklahoma/3052/09（2009年大流行株）和H3N2 A/Oklahoma/309/06等IAV株的复制均显示出显著的抑制作用。与其它实验不同，我们没有观察到单敲除和双敲除细胞之间的显著差异。

最后，我们研究了在DKO细胞中过表达TNKS1和/或TNKS2是否能够逆转TNKS1和TNKS2敲除对IAV感染的影响。过表达TNKS1和TNKS2的细胞显示出病毒NP蛋白水平的恢复，但并未完全恢复到野生型细胞的水平。这可能是因为N端的FLAG标签干扰了蛋白质的正常功能或定位，或者过表达的启动子无法复制内源性表达的时间、调控或表达水平，这可能是完全发挥功能所必需的。

在体内实验中，我们使用了TNKS1或TNKS2敲除小鼠来评估它们对IAV感染的影响。我们首先研究了TNKS1敲除小鼠。WT和TNKS1敲除小鼠被感染以亚致死剂量的A/PR/8/34（160 PFU/小鼠），并在3天和7天后收集肺组织样本。TNKS1敲除小鼠肺部中病毒NP和NS1蛋白的表达水平分别降低了89%和79%。此外，TNKS1敲除小鼠肺部中病毒NP的mRNA表达在3天后也显著降低。TNKS1敲除小鼠在3天和7天后肺部病毒滴度分别减少了2到1.5倍。IFN-β1的mRNA表达在TNKS1敲除小鼠肺部中显著增加。

我们还进行了生存实验，以评估TNKS1的缺失是否能保护小鼠免受致死性IAV感染。WT和TNKS1敲除小鼠被感染以2倍MLD50的A/PR/8/34（320 PFU/小鼠），并被监测其体重变化、临床症状和生存率。TNKS1敲除小鼠在致死性IAV感染中显示出显著的生存率提高。TNKS1敲除小鼠体重下降较少，临床评分也较低。

同样地，我们对TNKS2敲除小鼠进行了类似研究。WT和TNKS2敲除小鼠在感染后肺部中病毒NS1蛋白的表达水平在7天后减少了51%。病毒NP和NS1的mRNA水平也有所下降。在3天后，肺部病毒滴度显著减少。IFN-β1的mRNA表达在7天后增加。TNKS2敲除小鼠在IAV感染后生存率提高，体重下降较少，临床评分也较低。这些结果表明，TNKS1或TNKS2的缺失在小鼠中抑制了IAV复制并提高了生存率。

在机制上，我们的数据支持TNKS敲除通过激活I型干扰素反应来减少IAV感染。观察到以下现象：（1）TNKS双敲除在IAV感染期间诱导了IFN-β1的mRNA和蛋白表达；（2）TNKS双敲除增加了Stat1的磷酸化；（3）TNKS双敲除通过ISRE报告基因检测增强了Stat1的转录活性；（4）TNKS双敲除诱导了ISGs的表达。此外，TNKS1或TNKS2敲除小鼠在IAV感染的肺部中显示出IFN-β1的mRNA表达增加。值得注意的是，本研究中使用的是全身敲除小鼠，而小鼠肺部包含多种细胞，如上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞，这些细胞在不同水平上参与I型干扰素反应。因此，体内实验结果的解释比体外研究更为复杂。

TNKS是Axin的负调控因子。我们之前的研究表明，Axin1的过表达激活了JNK/c-Jun信号通路，并增加了I型干扰素的表达。本研究提供了证据，证明TNKS敲除介导的I型干扰素表达增加是通过Axin1-JNK/c-Jun信号通路实现的：（1）TNKS敲除细胞和小鼠中Axin1蛋白水平增加；（2）TNKS敲除介导的IAV感染减少被敲除Axin1所逆转；（3）TNKS双敲除激活了JNK/c-Jun信号通路，这通过c-Jun的磷酸化和JNK/AP-1报告基因检测的增加得到证实。

综上所述，我们发现TNKS敲除在体外和体内均能通过激活I型干扰素诱导的抗病毒先天免疫来抑制流感病毒的感染。本研究的结果可能有助于我们对以宿主因子为目标的下一代流感治疗药物的理解。