一种适用于分枝杆菌（包括结核分枝杆菌）的通用、高质量且高产率的DNA纯化方法：氯仿-珠法的大规模评估

《Microbiology Spectrum》：A universal, high-quality, and high-yield DNA purification method for mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis: large-scale assessment of the chloroform-bead method

基因组分析中高效提取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌高纯度DNA的新方法——氯仿-珠法，通过化学和机械双重破坏细胞壁脂质层，显著提升DNA产量（17.9 vs 1.9 μg）和纯度（A260/A230 1.86 vs 1.22），16实验室验证显示该方法适用于结核分枝杆菌，单中心验证覆盖32种非结核分枝杆菌，处理时间从3天缩短至2小时且完全灭菌。

　　在当前全球范围内，结核病仍然是一个重要的公共卫生问题，每年新增病例和死亡人数均令人担忧。与此同时，非结核分枝杆菌（NTM）感染的发病率也在持续上升，特别是在高收入国家中，NTM感染的病例数甚至超过了结核病。这些病原体因其独特的细胞壁结构，尤其是富含脂质的分枝菌酸，使得从其细胞中提取高质量的基因组DNA变得极具挑战性。传统方法通常依赖酶解技术，如溶菌酶处理，但这些方法在实际操作中存在诸多局限，包括步骤繁琐、耗时较长、结果不稳定以及对不同物种的适用性有限。因此，开发一种快速、高效且适用于多种结核分枝杆菌的DNA提取方法，对于提升基因组研究和临床诊断的效率至关重要。

本研究提出了一种名为“氯仿珠法”（Chloroform-bead method，简称CB方法）的新型DNA提取技术，该方法通过结合化学和机械破坏手段，有效克服了结核分枝杆菌细胞壁结构带来的挑战。与传统的酶解方法相比，CB方法无需使用溶菌酶，简化了提取流程，同时提高了DNA产量和纯度。在一项涉及16个实验室的多中心评估中，CB方法在提取结核分枝杆菌DNA时，平均产量达到了17.9微克，显著高于传统方法的1.9微克，且DNA纯度指标A260/A230比值也更高（1.86 vs. 1.22）。此外，CB方法在处理时间上表现出显著优势，将原本需要2至3天的流程缩短至仅需约2小时，这不仅提高了工作效率，也降低了实验成本。

为了验证CB方法的广泛适用性，研究团队还对其在非结核分枝杆菌中的表现进行了大规模单中心评估，涵盖了超过1,058个NTM菌株和1,000个结核分枝杆菌菌株。结果显示，CB方法在提取NTM DNA时同样表现出色，平均产量为22.2微克，与结核分枝杆菌的平均产量相近。DNA纯度指标同样保持较高水平，A260/A280比值在1.94至1.92之间，A260/A230比值在1.96至1.91之间，均符合高质量DNA的标准。此外，CB方法在DNA分子量和完整性方面也优于传统方法，表现出更高的DNA完整性指数（DIN）和更长的DNA片段长度，这使得其在长读长测序技术（如PacBio HiFi、Nanopore和Illumina）中具有显著优势。

在实际应用中，CB方法的另一个重要特点是其安全性。通过实验验证，CB方法能够有效灭活结核分枝杆菌，确保提取后的样本不会对实验室人员造成感染风险。这为该方法在临床诊断和大规模研究中的推广提供了保障。此外，CB方法的标准化流程使其在不同实验室间具有良好的可重复性，这对于推动全球范围内结核病和NTM感染的基因组研究具有重要意义。

为了进一步探讨CB方法的作用机制，研究团队利用扫描电子显微镜（SEM）对处理后的结核分枝杆菌细胞进行了观察。结果显示，未经处理的细胞保持了典型的杆状形态，而经过CB处理的细胞表面则覆盖了水不溶性结构，表明氯仿有效地去除了细胞壁中的脂质成分，同时珠磨技术对细胞壁进行了机械破坏，从而释放出完整的DNA。这种结合化学和机械手段的处理方式，不仅提高了DNA提取的效率，还减少了对细胞结构的破坏，使得提取的DNA具有较高的分子量和完整性。

尽管CB方法在多个方面展现出显著优势，但其仍然存在一些需要进一步优化的方面。首先，氯仿和酚的使用可能带来环境和安全风险，因此未来需要探索更加环保和安全的替代方案。其次，虽然CB方法在处理结核分枝杆菌时能够完全灭活细菌，但针对其他NTM菌株的灭活效果仍需进一步验证。此外，由于本研究主要集中在结核分枝杆菌和部分NTM菌株，对于更多种类的NTM，其在不同实验室间的提取效果仍需更多的数据支持。

总体而言，CB方法为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的基因组研究提供了一种全新的解决方案。它不仅简化了DNA提取流程，还显著提高了DNA产量和质量，同时确保了实验的安全性。这一方法的推广将有助于推动结核病和NTM感染的基因组学研究，为精准医学和公共卫生政策提供更加可靠的数据支持。未来，随着技术的不断优化和验证，CB方法有望成为实验室中提取结核分枝杆菌DNA的首选方法，并为相关研究领域带来深远的影响。