利用CRISPRi功能基因组学和转录组学技术，研究伯克霍尔德菌复合群（Burkholderia cepacia complex）中的噬菌体-宿主相互作用，以揭示宿主因子和噬菌体抗性基因

《Microbiology Spectrum》：Exploring phage–host interactions in Burkholderia cepacia complex bacterium to reveal host factors and phage resistance genes using CRISPRi functional genomics and transcriptomics

噬菌体与宿主互作机制研究：以Burkholderia cenocepacia K56-2为模型

　　这项研究聚焦于细菌与噬菌体之间的复杂相互作用，特别是以一种名为*B. cenocepacia* K56-2的细菌为研究对象，与一种来自*B. multivorans*的温和噬菌体Bcep176进行相互作用分析。通过整合功能基因组学和转录组学的方法，研究人员揭示了*K56-2*在噬菌体感染过程中表现出的主动抗噬菌体机制以及相关宿主因子基因。这些发现不仅有助于理解*B. cenocepacia*及其噬菌体在自然生态系统中的生态位，还为设计针对这些细菌的噬菌体疗法提供了重要的理论基础和实践指导。

*B. cenocepacia*复合体细菌广泛存在于土壤中，同时是免疫功能低下患者的条件性病原体。这类细菌具有天然的抗生素抗性，使得传统抗生素治疗变得困难，因此，噬菌体疗法作为一种潜在的替代治疗手段，受到了越来越多的关注。然而，由于*B. cenocepacia*并非模式细菌，其抗噬菌体机制和宿主因子的研究仍然面临诸多挑战。本研究中，研究人员利用一个全基因组的dCas9敲低文库，对*B. cenocepacia* K56-2进行了感染实验，并结合噬菌体感染后的转录组分析，识别出63个新的宿主因子或抗噬菌体基因。随后，通过单基因敲低实验验证了部分候选基因的功能，进一步明确了这些基因在噬菌体感染中的作用。

在噬菌体感染的早期阶段，研究人员观察到*B. cenocepacia* K56-2的细菌浓度显著下降，同时噬菌体的繁殖能力迅速上升。这一现象表明，细菌在感染初期可能表现出一定的敏感性，但随着时间推移，细菌似乎发展出了一种抗性机制，可能与噬菌体的溶菌性或溶源性有关。在转录组分析中，研究人员发现，在感染后的4小时内，编码宿主因子和抗噬菌体候选基因的基因表达发生了显著变化，这为理解细菌如何在感染过程中调控其自身基因表达提供了重要线索。

通过计算方法预测的抗噬菌体系统、常见噬菌体受体基因以及基因组岛（genomic islands）为噬菌体-宿主相互作用的基因组景观提供了初步认识。研究人员预测了12种抗噬菌体系统、6种抗噬菌体系统候选基因以及6种潜在的噬菌体受体基因，并识别了8个基因组岛，其中包括两个前噬菌体、一个整合性接合元件和五个功能未知的基因组岛。这些预测结果为进一步实验验证提供了理论基础。

在实验验证方面，研究人员使用了CRISPRi技术，通过构建一个全基因组的dCas9敲低文库，对*B. cenocepacia* K56-2在感染Bcep176时的基因表达变化进行了系统分析。通过比较不同时间点（6小时和24小时）的噬菌体感染情况，研究人员发现有65个基因在感染过程中表现出显著的适应性变化，其中24个被鉴定为宿主因子，41个被鉴定为抗噬菌体基因。此外，还有14个基因被认定为必需基因，这些基因的表达变化可能反映了细菌在感染过程中的生存策略。这些结果表明，噬菌体感染可能激活或抑制特定的宿主基因，从而影响细菌的生长状态和噬菌体的传播效率。

值得注意的是，尽管通过计算方法预测了多种抗噬菌体系统，但在CRISPRi实验中，这些系统并未表现出显著的抗噬菌体活性。这可能是因为这些抗噬菌体系统在*B. cenocepacia*中可能以低拷贝数存在，或者它们的功能在该菌株中并未被完全激活。此外，由于*B. cenocepacia*在进化上与常见的模式细菌（如*E. coli*、*B. subtilis*和*Salmonella*）存在较大差异，这些预测的抗噬菌体系统可能并不适用于该菌株。因此，研究团队建议未来的研究需要更多地关注非模式细菌中的新型抗噬菌体机制，并探索如何在这些菌株中有效识别和验证抗噬菌体系统。

在进一步的验证过程中，研究人员发现一些宿主因子基因在感染后表现出下调趋势，而抗噬菌体基因则表现出上调或下调的不同模式。例如，一些抗噬菌体基因在感染后期显著上调，可能与细菌的防御机制有关；而另一些基因则在感染初期就表现出变化，可能与噬菌体的吸附或入侵过程相关。这些发现不仅揭示了*B. cenocepacia* K56-2在应对噬菌体感染时的动态基因调控机制，还为理解细菌如何通过基因表达变化来适应噬菌体攻击提供了新的视角。

此外，研究人员还观察到一些基因在感染过程中表现出显著的适应性变化，这些基因可能在细菌的生存策略中扮演重要角色。例如，一些与核糖体生物合成相关的基因在感染后显著下调，这可能表明细菌在感染过程中抑制了自身的蛋白质合成，从而减少噬菌体利用宿主资源进行复制的机会。另一些与脂多糖（LPS）合成相关的基因则在感染后显著上调，这可能与噬菌体通过LPS作为受体进行感染有关。这些基因的表达变化为噬菌体与宿主之间的相互作用提供了新的分子机制。

研究还发现，一些与群体感应（quorum sensing）相关的基因被识别为抗噬菌体候选基因。群体感应是细菌通过感知周围环境中细胞密度变化来调控基因表达的一种机制，它在微生物群落中具有重要的生态意义。研究表明，群体感应基因可能通过调节细菌的细胞密度，影响噬菌体的感染效率。这一发现为理解噬菌体在自然环境中的传播和宿主适应性提供了新的理论依据。

在实验方法方面，研究人员采用了一种基于rhamnose诱导的dCas9系统，构建了一个全基因组的CRISPRi敲低文库，并通过RNA测序技术分析了感染过程中基因表达的变化。这种方法不仅能够全面地识别宿主因子和抗噬菌体基因，还能通过比较不同条件下的基因表达水平，评估这些基因在噬菌体感染中的具体作用。此外，研究人员还使用了HTSeq和DeSeq2等工具，对基因表达数据进行了统计分析，从而确定哪些基因在感染过程中发生了显著变化。

研究团队还注意到，一些基因在未感染的条件下表现出显著的表达变化，而在感染过程中则没有明显的差异。这些基因可能属于必需基因，它们的表达变化可能与细菌的正常生理活动有关，而不是直接参与噬菌体感染过程。因此，在识别抗噬菌体基因和宿主因子时，需要排除这些必需基因的影响，以确保结果的准确性。

通过这些研究，科学家们不仅揭示了*B. cenocepacia* K56-2在噬菌体感染过程中的基因表达变化，还发现了许多新的宿主因子和抗噬菌体基因。这些基因的识别和功能验证为噬菌体疗法的发展提供了重要的基因资源，同时也为未来研究噬菌体在非模式细菌中的作用机制提供了新的方向。例如，研究人员发现，一些基因在感染过程中表现出显著的适应性变化，这可能意味着它们在噬菌体感染中扮演着关键角色，或者它们的表达变化反映了细菌对噬菌体攻击的响应策略。

总体而言，这项研究通过整合功能基因组学和转录组学的方法，系统地揭示了*B. cenocepacia* K56-2在感染Bcep176时的基因表达变化和抗噬菌体机制。这些发现不仅有助于理解噬菌体与宿主之间的复杂相互作用，还为未来设计更有效的噬菌体疗法和基因工程提供了理论基础和实验支持。同时，研究也指出了当前在非模式细菌中研究噬菌体-宿主相互作用所面临的挑战，包括基因组的复杂性、基因表达的动态变化以及抗噬菌体系统的多样性。未来的研究需要进一步探索这些基因的功能，以及它们在不同噬菌体感染中的作用机制，以期为噬菌体在生物技术和医学中的应用提供更全面的理解。