由于抗氧化酶YqhD介导的外排泵活性降低，沙门氏菌对胆汁压力的耐受性受损

《mSphere》：The resilience of Salmonella to bile stress is impaired due to the reduced efflux pump activity mediated by the antioxidant enzyme YqhD

研究揭示沙门氏菌YqhD基因通过调节AcrAB外排泵活性影响胆汁盐抗性。删除YqhD后，菌株在胆汁盐环境中生存能力增强，并伴随氧化应激水平升高及肝脾组织载量增加，尤其在高脂饮食小鼠中表现显著。机制涉及RamA/R调控系统介导的AcrAB外排泵激活，而氧化应激通过SodA/B基因调控。研究结果为理解沙门氏菌在胆汁盐环境中的致病机制提供了新视角。

　　### 解读：YqhD基因在沙门氏菌对胆盐敏感性中的作用

在现代医学和微生物学研究中，胆盐对宿主肠道环境的影响一直备受关注。胆盐不仅在消化脂肪和吸收脂溶性维生素中发挥关键作用，还能够通过多种机制影响病原体的生存能力。这种影响可能涉及直接的抗菌作用，例如破坏细菌细胞膜、产生活性氧（ROS）并造成DNA损伤。然而，某些病原体，如沙门氏菌，已经进化出应对胆盐的策略，使其能够在宿主的肠道和胆囊中生存。本研究聚焦于YqhD这一新型抗氧化基因在沙门氏菌对胆盐敏感性中的作用，揭示了其在调控胆盐应答中的复杂机制。

#### 胆盐的抗菌特性与沙门氏菌的适应机制

胆盐在宿主体内由肝脏细胞合成，其主要功能是帮助消化脂肪和促进脂溶性维生素的吸收。然而，胆盐还具有抗菌特性，通过破坏细菌细胞膜和引发ROS的产生，对细菌造成损伤。这种作用对于肠道微生物群落的维持具有重要意义，但也对某些病原体如沙门氏菌的生存构成挑战。沙门氏菌属于肠杆菌科，是常见的食源性病原体，能够引起多种感染，如伤寒和副伤寒。为了在胆盐环境中生存，沙门氏菌通过多种机制进行适应，包括改变细胞膜结构、调节抗性基因表达以及激活抗氧化系统。

在本研究中，研究人员发现YqhD基因的缺失显著提高了沙门氏菌在胆盐环境下的存活率。这一结果表明，YqhD在沙门氏菌对胆盐的敏感性中起着关键作用。在体外实验中，当沙门氏菌被7%的胆盐处理时，YqhD的表达显著下降，而YqhD缺失的菌株表现出更高的存活率。这提示YqhD可能通过某种方式抑制沙门氏菌对胆盐的敏感性，其缺失则增强了菌株的胆盐耐受能力。

#### YqhD基因的功能与作用机制

YqhD是一种依赖NADPH的醛还原酶，其辅因子为锌。在文献中，YqhD被广泛研究，主要因其在抗氧化功能和生物燃料生产中的作用。然而，本研究发现YqhD在沙门氏菌中不仅具有抗氧化功能，还参与调控胆盐应答。具体而言，YqhD通过调节AcrAB外排泵的活性，影响沙门氏菌对胆盐的敏感性。AcrAB外排泵是沙门氏菌中一种重要的外排系统，能够将胆盐等有害物质排出细胞外，从而降低其毒性作用。研究显示，YqhD缺失的菌株表现出更高的AcrAB外排泵活性，这可能是其在胆盐环境下存活率增加的原因之一。

此外，研究还发现，YqhD的缺失导致沙门氏菌在胆盐暴露下ROS水平的升高。虽然ROS通常被认为是有害的，但其在某些情况下可能成为沙门氏菌适应胆盐环境的“双刃剑”。在YqhD缺失的菌株中，ROS的增加可能激活某些应激反应基因，如acrB，从而促进外排泵的表达和活性。然而，当加入抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione）时，YqhD缺失的菌株的存活率并未显著增加，反而STM WT菌株的存活率有所提升。这一结果表明，YqhD在沙门氏菌对胆盐的敏感性中起着关键作用，而ROS的增加可能是其耐受胆盐的辅助机制。

#### 高脂肪饮食对沙门氏菌胆盐敏感性的影响

现代生活方式的改变，特别是高脂肪饮食（HFD）的普及，对肠道微生物群落和宿主免疫系统产生了深远影响。HFD通常含有36–40%的脂肪，这种饮食模式不仅会引发肠道炎症，还可能导致肠道菌群失衡，即厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加，同时肠杆菌科的相对丰度上升。这种变化为沙门氏菌的生长提供了有利条件，因为胆盐的分泌会增强其在肠道中的定植能力。

在本研究中，研究人员发现当C57BL/6小鼠被喂食高脂肪饮食后，YqhD缺失的沙门氏菌在结肠中的定植能力显著增强。具体而言，YqhD缺失的菌株在高脂肪饮食处理后，其在结肠中的组织负担比野生型（STM WT）菌株高出约2个数量级。这一现象与文献中的观察一致，表明高脂肪饮食可能通过促进胆盐的分泌，增强沙门氏菌的定植能力。此外，YqhD缺失的菌株在肝脏和脾脏中的组织负担也显著增加，尤其是在高脂肪饮食条件下，这种趋势更为明显。

#### YqhD与RamA/R调控系统的相互作用

YqhD的缺失不仅影响外排泵的活性，还与RamA/R调控系统密切相关。RamA是一种调控因子，能够激活AcrAB外排泵的表达。在YqhD缺失的菌株中，RamA的表达显著上调，这可能与胆盐诱导的ROS水平有关。当ROS水平升高时，RamA的表达也随之增强，从而进一步激活AcrAB外排泵。这种调控机制可能是沙门氏菌在高脂肪饮食和胆盐环境下存活率增加的关键。

然而，这一调控过程并非完全依赖于ROS。在某些情况下，即使加入抗氧化剂谷胱甘肽，YqhD缺失的菌株的存活率仍然显著高于野生型菌株。这表明，YqhD的缺失可能通过其他机制影响外排泵的活性，例如通过改变基因表达或影响调控网络。进一步的研究发现，YqhD缺失的菌株在RamA缺失的情况下，其存活率显著下降，这表明RamA在YqhD缺失导致的外排泵激活中起着核心作用。

#### YqhD缺失对沙门氏菌侵袭能力的影响

尽管YqhD的缺失增强了沙门氏菌在胆盐环境下的存活能力，但其对侵袭能力的影响却较为复杂。在体外实验中，研究人员发现YqhD缺失的菌株在结肠癌细胞（Caco-2）中的侵袭能力与野生型菌株相似，但在肝细胞（HepG2）中的侵袭能力显著降低。这一现象可能与胆盐对沙门氏菌侵袭机制的调控有关。

沙门氏菌的侵袭能力主要依赖于其Ⅲ型分泌系统（T3SS），特别是SPI-1编码的侵袭基因。在HepG2细胞中，YqhD缺失的菌株表现出较低的侵袭能力，这可能与其SPI-1基因的表达受到抑制有关。然而，当通过基因敲除技术降低胆盐合成能力后，YqhD缺失的菌株的侵袭能力并未显著恢复，这表明侵袭能力的降低可能与YqhD缺失本身有关，而非胆盐的直接作用。因此，YqhD缺失对侵袭能力的影响可能涉及多个层面，包括基因表达调控、细胞膜结构变化以及代谢途径的调整。

#### YqhD缺失对宿主免疫应答的影响

在宿主免疫应答方面，YqhD的缺失对沙门氏菌的存活和组织负担产生了显著影响。在C57BL/6小鼠中，YqhD缺失的菌株在胆盐处理后表现出更高的组织负担，尤其是在肝脏和脾脏中。这可能与YqhD在维持宿主免疫平衡中的作用有关。当YqhD缺失时，沙门氏菌可能更容易逃避宿主免疫系统的清除，从而在组织中持续增殖。

此外，研究人员还发现，在NADPH缺乏的gp91^phox?/?小鼠中，YqhD缺失的菌株的存活率与野生型菌株相似。这表明YqhD在沙门氏菌的存活中可能依赖于宿主的NADPH依赖性氧化酶系统。在正常小鼠中，YqhD的缺失导致沙门氏菌在胆盐处理后表现出更高的存活率，而在NADPH缺乏的小鼠中，这种优势则被削弱。这提示YqhD的缺失可能通过增强ROS的产生，间接影响宿主免疫应答，从而促进沙门氏菌的存活。

#### YqhD缺失对宿主病理反应的影响

在宿主病理反应方面，YqhD的缺失导致沙门氏菌感染后，肝脏和脾脏的组织病理学变化更为显著。具体而言，YqhD缺失的菌株在高脂肪饮食条件下，感染小鼠的肝脏和脾脏表现出更严重的炎症反应和组织损伤。这一现象可能与YqhD在维持宿主免疫平衡中的作用有关，其缺失可能导致宿主免疫系统对沙门氏菌的反应更加剧烈。

此外，研究人员还发现，YqhD缺失的菌株在感染后，小鼠体重减轻更为显著。这可能与沙门氏菌在感染过程中对宿主资源的消耗有关。在YqhD缺失的情况下，沙门氏菌可能更容易在宿主组织中增殖，从而导致宿主营养状态的恶化。这一结果进一步支持YqhD在沙门氏菌与宿主相互作用中的重要性。

#### YqhD缺失的潜在临床意义

本研究揭示了YqhD在沙门氏菌胆盐敏感性中的关键作用，这为理解沙门氏菌的慢性携带状态提供了新的视角。慢性携带状态是指沙门氏菌在宿主体内长期潜伏，而不引起明显症状，这在公共卫生领域具有重要意义。YqhD的缺失可能导致沙门氏菌更容易在胆盐环境中存活，从而增加其在宿主体内的持续性和传播能力。

此外，YqhD的缺失还可能影响沙门氏菌的耐药性。由于AcrAB外排泵的激活，YqhD缺失的菌株可能更容易对多种抗生素产生耐药性，这为临床治疗带来了挑战。因此，理解YqhD在沙门氏菌耐药性中的作用，有助于开发新的抗菌策略。

#### 研究方法与技术手段

为了探究YqhD在沙门氏菌胆盐敏感性中的作用，研究人员采用了多种实验方法，包括体外培养、基因敲除、RNA-Seq分析以及动物模型实验。在体外实验中，研究人员通过调整菌株的生长条件，观察其在不同胆盐浓度下的存活率变化。在基因敲除实验中，研究人员利用lambda red重组酶系统，构建了YqhD缺失的菌株，并通过qRT-PCR和荧光检测等技术，分析其在不同条件下的基因表达变化。

在动物模型实验中，研究人员将YqhD缺失的菌株接种到C57BL/6小鼠体内，并观察其在不同饮食条件下的组织负担变化。通过比较高脂肪饮食与普通饮食条件下，YqhD缺失的菌株在肝脏、脾脏等组织中的定植能力，研究人员发现YqhD缺失的菌株在高脂肪饮食条件下表现出更高的组织负担。这一结果为理解YqhD在宿主-病原体相互作用中的作用提供了重要依据。

#### 研究的局限性与未来方向

尽管本研究揭示了YqhD在沙门氏菌胆盐敏感性中的重要作用，但仍存在一些局限性。例如，YqhD如何具体调控RamA/R调控系统的机制尚不明确。此外，YqhD缺失对沙门氏菌侵袭能力的影响可能涉及其他未被研究的因子，这些都需要进一步探索。

未来的研究可以关注YqhD在不同宿主细胞中的具体作用机制，以及其与其他抗性基因的相互作用。此外，还可以探讨YqhD缺失对沙门氏菌耐药性和慢性携带状态的影响，以期为抗感染治疗提供新的思路。随着对YqhD及其调控网络的深入了解，有望开发出针对沙门氏菌的新型干预策略，从而减少其对宿主的威胁。

#### 结论

综上所述，YqhD在沙门氏菌对胆盐的敏感性中起着关键作用。其缺失不仅提高了沙门氏菌在胆盐环境下的存活能力，还可能影响其在宿主体内的定植和传播。通过调控AcrAB外排泵的活性，YqhD缺失的菌株能够在胆盐环境下获得生存优势。然而，YqhD的缺失也可能导致沙门氏菌侵袭能力的降低，这可能与胆盐对SPI-1基因的调控有关。未来的研究需要进一步揭示YqhD在沙门氏菌与宿主相互作用中的具体机制，以期为公共卫生和临床治疗提供新的理论依据和实践指导。