通过互补的1H和31P{1H} DOSY核磁共振技术解析壳聚糖的磷酸化过程

《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》：Deciphering the phosphorylation of chitosan through complementary 1H and 31P{1H} DOSY NMR

磷酸化试剂与壳聚糖主链的共价结合机制研究。采用DOSY NMR技术结合FTIR和常规NMR分析，系统评估了磷酸、亚磷酸及二甲基磷ite三种试剂对壳聚糖的改性效果。结果表明，前两者形成的磷物种具有显著高扩散系数（394-548×10-12 m2/s），表明非共价结合；而二甲基磷ite改性产物磷信号扩散系数（11×10-12 m2/s）与壳聚糖主链接近，证实共价结合。该方法为生物高分子功能化修饰提供了快速鉴别共价/非共价结合的新范式。

　　近年来，随着可持续发展和环保意识的提升，人们对可再生材料的需求日益增长。传统材料，尤其是塑料制品，因其对环境的长期影响而受到越来越多的关注。因此，天然多糖类材料作为替代传统塑料的环保材料，逐渐成为研究的热点。其中，壳聚糖作为一种天然来源的多糖，因其独特的结构和优良的生物相容性、生物降解性等特性，广泛应用于医药、食品、生物材料等多个领域。然而，壳聚糖在常规有机溶剂中几乎不溶，这限制了其在一些应用中的表现。为了解决这一问题，许多研究者通过化学修饰来改善其性能，其中，磷酸化是一种重要的改性方法。

磷酸化能够显著改善壳聚糖的溶解性、亲水性、阻燃性、生物相容性以及金属螯合能力。这些改性不仅拓宽了壳聚糖的应用范围，也使其在药物输送、水凝胶、电解质膜等高附加值材料中展现出更大的潜力。然而，尽管已有大量研究报道了壳聚糖磷酸化后化学结构的变化，但确认磷酸化试剂是否通过共价键与壳聚糖主链结合，还是仅通过非共价相互作用附着在聚合物表面，仍然是一个挑战。传统的分析技术如傅里叶变换红外光谱（FTIR）和常规的一维（1D）或二维（2D）核磁共振（NMR）光谱虽然可以检测到磷酸基团的存在，却难以区分其与壳聚糖主链之间的连接方式。

为了更准确地评估磷酸化过程中的化学键合情况，研究者们引入了一种新的分析方法——扩散有序核磁共振（DOSY NMR）。该技术通过测量不同分子在溶液中的扩散系数，能够有效区分分子间的共价连接与非共价结合。DOSY NMR基于脉冲梯度场核磁共振原理，能够在不破坏分子结构的前提下，获取其在溶液中的扩散行为信息。在本研究中，通过同时使用¹H和³¹P{¹H} DOSY NMR技术，对三种不同的磷酸化试剂——磷酸、偏磷酸和二甲基磷酸酯进行了系统分析。研究结果表明，这三种试剂在壳聚糖改性过程中表现出不同的行为，其中仅二甲基磷酸酯导致了与壳聚糖主链具有相似扩散系数的磷酸基团，从而提供了共价键合的有力证据。

在实验过程中，壳聚糖首先被溶解在1%（体积/体积）的乙酸水溶液中，随后分别加入磷酸、偏磷酸和二甲基磷酸酯作为磷酸化试剂。对于磷酸和偏磷酸处理的样品（PCS1和PCS2），反应过程中形成了大量自由扩散的磷酸基团，其扩散系数显著高于壳聚糖主链的扩散系数（4-9×10^-12 m²/s），这表明这些磷酸基团并未与壳聚糖形成稳定的共价键，而是以非共价形式存在于溶液中。相反，使用二甲基磷酸酯处理的样品（PCS3）则表现出与壳聚糖主链相似的扩散行为，其扩散系数接近11×10^-12 m²/s，与壳聚糖主链的扩散系数相近，这说明二甲基磷酸酯能够与壳聚糖主链形成稳定的共价键。

为了进一步验证这一结论，研究者们还对不同磷酸化试剂的反应机理进行了分析。研究表明，磷酸（H₃PO₄）和偏磷酸（H₃PO₃）在酸性条件下容易与壳聚糖的氨基发生反应，生成离子形式的磷酸基团，而这些基团无法形成稳定的共价键，因此在DOSY NMR中表现出较高的扩散系数。相比之下，二甲基磷酸酯由于其中性化学性质，能够在反应过程中不干扰壳聚糖的成环反应，从而形成稳定的共价键。这种共价键合不仅提高了壳聚糖的稳定性，还使其在各种环境条件下保持性能不变，为开发高性能的生物材料提供了新的思路。

此外，研究还发现，磷酸化过程中可能伴随一些副反应，如甲基化反应。这些副反应产生的产物如N-甲基壳聚糖和N,N-二甲基壳聚糖，在DOSY NMR中表现出不同的扩散行为。这表明，在某些反应条件下，磷酸化试剂可能不仅与壳聚糖主链发生反应，还可能引发其他化学变化，影响最终产物的结构和性能。因此，为了更全面地理解磷酸化过程，有必要对反应条件进行优化，以减少副反应的发生，提高目标产物的产率和纯度。

本研究的另一个重要发现是，通过同时分析¹H和³¹P{¹H} DOSY NMR数据，可以更准确地判断磷酸基团是否与壳聚糖主链形成共价键。这不仅为壳聚糖的磷酸化提供了新的分析手段，也为其他生物聚合物的改性研究提供了参考。通过这种方法，研究人员能够快速、简便地区分不同磷酸化试剂的反应效果，从而为实际应用提供科学依据。

总的来说，这项研究通过结合¹H和³¹P{¹H} DOSY NMR技术，首次系统地评估了壳聚糖在不同磷酸化试剂作用下的化学键合情况。研究结果表明，二甲基磷酸酯是唯一能够与壳聚糖主链形成共价键的试剂，而磷酸和偏磷酸则主要以非共价形式存在。这一发现不仅有助于深入理解壳聚糖的化学改性机制，也为开发高性能、环保的生物材料提供了新的方向。未来的研究可以进一步探索不同反应条件对磷酸化效率的影响，以及如何通过优化反应条件提高共价键合的比例，从而提升壳聚糖在各种应用中的性能。