六种虫媒病毒同步检测与登革热分型：高灵敏度RT-qPCR方法的建立与应用

《Clinical Chemistry》：B-209 Simultaneous Detection of Six Arboviruses: RT-qPCR for Zika, Chikungunya, Mayaro, Oropouche, Yellow Fever, and Dengue Subtyping (1, 2, 3, and 4)

本研究针对热带地区虫媒病毒引起的发热性疾病症状相似、鉴别诊断困难的问题，开发并验证了一种可同步检测寨卡病毒(Zika)、基孔肯雅病毒(Chikungunya)、马亚罗病毒(Mayaro)、奥罗普切病毒(Oropouche)、黄热病病毒(Yellow Fever)以及登革热病毒(Dengue)并实现登革热1-4型分型的RT-qPCR方法。结果显示该方法准确性达100%，检测限低至30-126 copies/mL，具有高灵敏度和特异性，为临床快速诊断和流行病学监测提供了有力工具。

　　

在巴西等热带国家，由蚊子传播的虫媒病毒引起的发热性疾病是常见的公共卫生问题。寨卡病毒(Zika Virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus)、马亚罗病毒(Mayaro Virus)、奥罗普切病毒(Oropouche Virus)、黄热病病毒(Yellow Fever Virus)和登革热病毒(Dengue Virus)等病原体不仅传播途径相似，引起的临床症状也高度重叠，如发热、皮疹、关节痛等，这使得临床医生单凭症状难以做出准确诊断。然而，不同的病毒感染其治疗方案、预后及公共卫生应对措施却大相径庭。例如，登革热病毒感染可能发展为严重的出血热，而寨卡病毒感染与新生儿小头畸形密切相关。因此，开发能够快速、准确鉴别这些病毒的诊断方法，对于指导临床治疗、实施有效隔离措施以及开展流行病学 surveillance 至关重要。

传统的病毒检测方法如病毒分离培养耗时长，血清学检测则存在交叉反应的可能。分子诊断技术，特别是逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)，因其高灵敏度、高特异性和快速出结果的优势，已成为病毒性传染病诊断的金标准。然而，面对多种临床症状相似的病原体，如果对每个病毒进行单独检测，不仅效率低下，成本高昂，还会消耗更多的珍贵临床样本。因此，研究能够同步检测多种相关病原体的多重PCR技术具有重要的现实意义。

为此，发表在《Clinical Chemistry》上的研究论文"B-209 Simultaneous Detection of Six Arboviruses: RT-qPCR for Zika, Chikungunya, Mayaro, Oropouche, Yellow Fever, and Dengue Subtyping (1,2,3, and 4)"介绍了一项验证一种可同时检测上述六种虫媒病毒并能对登革热病毒进行1至4型分型的RT-qPCR检测方法的研究。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：首先，他们利用自动化核酸提取仪从临床EDTA抗凝血浆样本中提取总核酸。其次，他们设计并采用了多重RT-qPCR反应体系，针对不同病毒靶点使用特异性引物和探针，并引入合成RNA作为外源性内标(IC)监控整个检测过程。最后，通过严格的统计学方法（如概率回归分析）确定检测限(LOD)，并利用已知样本进行准确性、重现性、精密度和特异性评估。

RESULTS

准确性 (Accuracy)

研究人员通过将新建立的同步检测方法的检测结果与已知的RT-qPCR结果或能力验证样本的结果进行比较，来评估其准确性。评估涵盖了所有目标病毒：寨卡病毒、基孔肯雅病毒、马亚罗病毒、奥罗普切病毒、黄热病病毒以及登革热病毒的1、2、3、4型。研究结果显示，对于所有靶标，该检测方法的准确性均达到了100%。这表明新方法能够准确无误地识别出目标病毒，没有出现假阳性或假阴性的结果。

重现性、精密度和特异性 (Reproducibility, precision, and specificity)

为了确保检测结果的可靠性和稳定性，研究人员进行了重现性和精密度实验。这些实验评估了同一批次内（批内）和不同批次间（批间）检测结果的一致性。结果表明，无论是批内还是批间，检测结果都表现出良好的一致性，说明该方法的操作稳定性高，重复性好。此外，特异性实验证实，该检测方法具有高度特异性，针对每种病毒设计的引物和探针只与其对应的目标病毒核酸发生反应，在检测过程中没有观察到任何非特异性交叉反应，这保证了鉴定结果的可靠性。

检测限 (Limit of Detection, LOD)

检测限是衡量检测方法灵敏度的重要指标，指的是能够稳定检测出的最低病毒载量。研究人员通过系列稀释病毒样本，并采用概率回归(Probit regression)分析来确定每个病毒靶标的最低检测限。获得的具体检测限（以copies/mL表示）如下：寨卡病毒为126 copies/mL；基孔肯雅病毒为110 copies/mL；马亚罗病毒为55 copies/mL；奥罗普切病毒为72 copies/mL；黄热病病毒为30 copies/mL；登革热病毒1型为54 copies/mL，2型为75 copies/mL，3型为69 copies/mL，4型为46 copies/mL。所有目标的检测限均低于130 copies/mL，表明该方法具有极高的灵敏度，能够检测出临床样本中极低浓度的病毒。

CONCLUSION

本研究成功验证了一种用于同步检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒、马亚罗病毒、奥罗普切病毒、黄热病病毒(YFV)和登革热病毒的多重RT-qPCR方法。该方法表现出极高的灵敏度，对所有目标的检测限均低于130 copies/mL。与参考方法相比，总体符合率为100%。自该方法实施以来，已成功用于515例发热综合征患者的诊断，其中包括检测到了奥罗普切病毒和马亚罗病毒等新发病原体。此外，该方法具备的登革热病毒分型能力，在流行病学 surveillance 中扮演着关键角色，能够追踪不同病毒血清型的传播动态，为公共卫生决策提供重要依据。总之，这项研究为热带地区虫媒病毒性疾病的快速、准确诊断和有效监控提供了一种强大而可靠的工具。