人血清pS129 α-突触核蛋白LC-MS/MS定量方法的开发与适用性验证及其在神经退行性疾病研究中的意义

《Clinical Chemistry》：B-258 Development and Fit-for-Purpose Analytical Validation of a LC-MS/MS Method for the Quantification of pS129 Alpha-synuclein in Human Serum

本研究针对帕金森病(PD)缺乏特异性生物标志物的临床挑战，开发并验证了一种用于定量人血清中磷酸化α-突触核蛋白(pS129)的LC-MS/MS方法。该方法采用免疫沉淀富集、固相萃取净化和PRM检测策略，验证结果显示其具有良好的精密度(CV 13%-16%)、准确度(回收率106%-132%)及稳定性，检测范围为80-2000 pg/mL。该方法的建立为PD的早期诊断和病程监测提供了可靠工具。

　　

帕金森病(Parkinson's Disease, PD)作为第二大神经退行性疾病，全球影响着数百万人的健康。其诊断主要依赖临床症状，如静止性震颤、运动迟缓和肌强直，但这些症状通常在疾病进展到中晚期才变得明显，此时大脑中多巴胺能神经元已经发生了不可逆的损伤。因此，寻找能够在疾病早期、甚至在症状出现之前就能识别PD的客观生物标志物，成为了该领域迫在眉睫的需求。这不仅有助于实现早期干预，延缓疾病进展，也对新药临床试验中精准筛选患者和评估疗效至关重要。

在PD的病理过程中，α-突触核蛋白(Alpha-synuclein, Asyn)的错误折叠和聚集形成路易体(Lewy bodies)是其核心特征。而在这个异常聚集的过程中，α-突触核蛋白在丝氨酸129位点发生磷酸化(phosphorylated at serine 129, pS129)是一个关键事件。研究表明，pS129 Asyn在PD患者脑组织中的水平显著升高，并且与疾病的严重程度相关。这使得pS129 Asyn被视为一个极具潜力的PD诊断生物标志物。然而，将其从基础研究推向临床应用面临巨大挑战，尤其是在血液这类复杂且蛋白丰度低的生物体液中实现精准定量。

为了应对这一挑战，来自礼来公司(Eli Lilly and Company)的Sarika Chauhan, Shamili Sammohi, Erpan Ahat, Gary Heady, Andrew Schade和Michael Hodsdon等研究人员，在《Clinical Chemistry》上发表了他们的研究成果，题为“Development and Fit-for-Purpose Analytical Validation of a LC-MS/MS Method for the Quantification of pS129 Alpha-synuclein in Human Serum”。他们致力于开发并严格验证一种基于液相色谱-串联质谱(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)的方法，用于可靠地定量检测人血清中的pS129 Asyn。

研究人员开展此项研究，旨在建立一种高特异性、高灵敏度的分析方法，以克服传统免疫学方法可能存在的交叉反应性问题，并为pS129 Asyn作为PD血液生物标志物的临床应用奠定坚实的方法学基础。他们的最终目标是提供一个稳健的分析工具，服务于未来与神经退行性疾病相关的研究和临床诊断。

为了达成这一目标，研究人员设计了一套严谨的实验方案。该方法的核心技术流程结合了免疫学富集的高特异性和质谱定量的高准确性。首先，他们利用对pS129位点具有高度特异性的抗体，从人血清样本中免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)富集目标蛋白pS129 Asyn。这一步有效地将极低浓度的目标蛋白从复杂的血清基质中分离出来。接着，为了进一步纯化样本并去除可能干扰后续质谱分析的盐类和杂质，他们采用了固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)技术进行样本净化。然后，使用胰蛋白酶(Trypsin)对富集到的蛋白质进行酶切，将其消化成更适合质谱分析的小分子肽段。研究人员特别关注了α-突触核蛋白的第81至96位氨基酸(aa81-96)所对应的肽段，作为定量的目标肽。在质谱分析环节，他们使用了高分辨的Orbitrap质谱仪，并采用了平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring, PRM)模式对目标肽段进行定量。这种模式能够提供高分辨的碎片离子信息，从而确保定量的高度特异性和准确性。为了校正样本处理过程中的损失和变异，他们在每个样本中都加入了稳定同位素标记的重链内标肽(heavy-labeled internal standard peptide)。整个实验的数据分析工作通过Skyline软件完成。该方法使用在2% SigMatrix基质中制备的五点校准曲线(浓度点为30, 100, 300, 1000, 2000 pg/mL)进行定量，并在每次实验中同时运行低浓度和高浓度的质控样本以确保数据质量。

RESULTS

分析精密度

研究人员对五个独立的血清样本（包括3份来自健康个体和2份来自患者的样本）进行了多达65次测量，这些样本的pS129 Asyn浓度范围在200 pg/mL到1500 pg/mL之间。分析结果显示，每个样本的总变异系数在13%到16%之间。这一结果表明，该方法在较宽的浓度范围内具有良好的重复性和中间精密度，能够为不同浓度的样本提供可靠的数据。

分析准确度

通过加标回收实验来评估方法的准确度。研究人员将已知浓度的重组pS129 Asyn蛋白（200 pg/mL和500 pg/mL）分别添加到健康人和患者的血清样本中，同时设置不加标的样本作为对照。计算得到的百分比回收率在106%到132%之间。这个范围表明该方法能够准确地测量血清中实际存在的pS129 Asyn含量，准确度符合方法学验证的要求。

分析特异性与干扰

为了确保该方法只对pS129 Asyn产生响应，而不受其他相似物质的干扰，研究人员测试了几种常见的潜在干扰物质。结果表明，高浓度的非磷酸化α-突触核蛋白、血红蛋白（可能来自溶血样本）以及脂质（用脂肪乳剂Intralipad模拟）均未对pS129 Asyn的定量产生显著干扰。这证明了该方法具有很高的特异性，能够准确区分磷酸化和非磷酸化的α-突触核蛋白，并且对临床样本中常见的基质效应不敏感。

分析灵敏度

灵敏度是评估检测方法能否检测到低浓度分析物的关键指标。该研究的空白限(Limit of blank)为47 pg/mL。功能分析灵敏度，即定量下限(Lower Limit of Quantitation)，被确定为81 pg/mL。这意味着该方法能够可靠地定量浓度高于81 pg/mL的pS129 Asyn，为检测低水平的生物标志物提供了可能。

样本稳定性

考虑到临床样本需要储存和运输，评估分析物在不同条件下的稳定性至关重要。研究人员将样本在4°C条件下储存了7天，结果显示pS129 Asyn的测量值相对误差在97%到122%之间，表明样本在冷藏条件下短期内稳定。此外，样本在-20°C和-80°C下经历最多五次冻融循环后，其浓度也未发生显著变化，证明了样本在经过反复冻融后仍能保持稳定，这对于长期研究非常有利。

分析测量范围、平行性与稀释线性

最终确定该方法的分析测量范围(Analytical Measurement Range)为80-2000 pg/mL，覆盖了在测试样本中观察到的浓度范围。平行性(Parallelism)实验通过稀释高浓度样本进行，结果显示在高达1:4的稀释比例下，测量值的相对误差在107%到112%之间，表明该方法对血清基质中存在的潜在干扰物质不敏感，稀释后的测量值与预期值吻合良好。稀释线性(Dilution Linearity)实验也显示了类似的结果，在1:4稀释下，相对误差在73%到103%之间，进一步证实了该方法在测量高于定量上限的样本时，可以通过稀释获得准确的定量结果。

CONCLUSION

综上所述，这项研究成功地开发并进行了全面的适用性分析验证，证实了所建立的LC-MS/MS方法是一种稳健、可靠的工具，可用于定量检测人血清中的pS129 α-突触核蛋白。该方法展现了优异的精密度、准确度、特异性、灵敏度以及良好的样本稳定性。其成功建立解决了在血液等复杂体液中精准检测低丰度磷酸化蛋白的技术难题。这项研究为将pS129 Asyn作为帕金森病及其他相关突触核蛋白病（如路易体痴呆）的潜在血液生物标志物提供了强大的方法学支持。未来，这一方法有望应用于大规模临床队列研究，进一步验证pS129 Asyn在疾病诊断、分期、预后判断以及治疗反应监测中的价值，从而推动神经退行性疾病领域的精准医疗发展。该研究成果发表于高水平的学术期刊《Clinical Chemistry》，也体现了其在临床化学和检验医学领域的重要影响力。