FOXK1通过p-AKT/AKT通路调控高糖诱导血管内皮细胞功能障碍的机制研究

本研究针对糖尿病视网膜病变(DR)中血管内皮功能障碍的分子机制，发现转录因子FOXK1在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中显著上调。通过功能实验证实FOXK1 knockdown可增强细胞活性与迁移、抑制凋亡与血管生成，并激活p-AKT/AKT信号通路。该研究首次揭示FOXK1/p-AKT/AKT轴在DR中的调控作用，为靶向治疗提供了新思路。

　　

在全球糖尿病患病率持续攀升的背景下，糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)作为最主要的眼部并发症，正成为严峻的公共卫生挑战。据统计，全球工作年龄人群中糖尿病患病者约5.37亿，其中DR患病率高达22.27%，严重损害患者的生存质量。尽管血管内皮功能障碍被公认为DR的核心病理机制，但其具体的分子病因仍不完全清楚。目前提出的机制包括蛋白激酶C激活、多元醇途径诱导、氧化应激放大、炎症级联反应激活以及晚期糖基化终末产物积累等。抗VEGF药物的出现代表了DR分子治疗的重大突破，但它们需要反复眼内注射，经济负担重，且约15-25%患者存在治疗抵抗，这些局限凸显了探索新分子通路和替代治疗策略的迫切性。

内皮细胞的结构改变和功能障碍在DR发病中起关键作用。叉头框(Forkhead box, FOX)蛋白家族包含43个进化保守的转录因子，是血管稳态的重要调节者，其失调可导致病理性血管生成。FOXK1是该家族中新发现的成员，作为转录调节因子通过DNA结合活性调控多种生物学过程，包括细胞周期、增殖/分化、代谢、凋亡、血管生成和致癌作用。虽然大量肿瘤学研究证实FOXK1在多种恶性肿瘤中发挥促癌作用，但其在DR中的病理生理作用仍不清楚。

基于GEO数据库GSE221521数据集的分析显示，DR患者外周血中FOXK1表达显著升高。为此，研究人员采用高糖(High Glucose, HG, 25 mmol/L)诱导的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)建立体外模型，系统研究FOXK1的功能作用及机制。

本研究主要采用以下关键技术方法：通过体外细胞培养建立高糖诱导的HUVECs功能障碍模型；使用定量实时聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blot, WB)检测基因和蛋白表达；采用CCK-8法检测细胞活性；通过流式细胞术分析细胞凋亡；使用Transwell实验评估细胞迁移能力；通过管形成实验评价血管生成能力；利用AKT抑制剂MK-2206进行通路验证实验。

FOXK1表达在DR患者血液和高糖诱导的HUVECs中上调

生物信息学分析显示DR患者外周血中FOXK1表达显著升高。体外实验表明，与低糖(Low Glucose, LG, 5.5 mmol/L)组相比，高糖(HG)处理的HUVECs中FOXK1的mRNA和蛋白表达均显著增加，而高渗甘露醇(Hyperosmotic Mannitol, HM)对照组无此变化，排除渗透压干扰，证实FOXK1上调是葡萄糖特异性效应。

FOXK1 knockdown增强高糖条件下HUVECs活性并抑制凋亡

通过siRNA成功敲低FOXK1表达后，CCK-8检测显示细胞活性显著提高，流式细胞术检测发现早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)比例下降。相反，FOXK1过表达则降低细胞活性并促进凋亡，证明FOXK1在高糖环境下负调控内皮细胞存活。

敲低FOXK1促进高糖条件下HUVECs迁移

Transwell实验表明，FOXK1敲低显著增强细胞迁移能力，而过表达则削弱此能力。实验通过台盼蓝排除法确保接种细胞数量和活性一致，排除存活率偏差对迁移结果的影响。

敲低FOXK1抑制高糖诱导的HUVECs血管生成能力和VEGF表达

管形成实验显示FOXK1敲低显著降低血管生成能力（管长度减少），过表达则促进管形成。同时，qRT-PCR检测发现FOXK1敲低使血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)表达显著下降，过表达则使其上升。

敲低FOXK1通过激活p-AKT/AKT信号通路调控HUVECs功能

WB检测发现，FOXK1敲低后p-AKT/AKT比值（通路活性指标）显著升高，提示p-AKT/AKT通路被激活。相比之下，HG组p-AKT/AKT表达显著低于LG和HM组。使用AKT抑制剂MK-2206处理可逆转FOXK1敲低对迁移、凋亡、血管生成和VEGF表达的调控作用，证实FOXK1通过抑制p-AKT/AKT通路介导内皮细胞功能障碍。

本研究结论表明，FOXK1通过抑制p-AKT/AKT信号通路，加剧高糖诱导的血管内皮细胞损伤，表现为细胞活性降低、迁移受阻、凋亡增加、血管生成和VEGF表达增强。讨论部分指出，与某些细胞类型不同，高糖环境导致内皮细胞功能受损，而FOXK1作为新兴调控因子，可能通过诱导线粒体功能障碍和氧化应激参与DR发展。AKT激活对内皮细胞存活至关重要，其通过调节eNOS产生NO、影响Bcl-2和p70等基因促进细胞生存。本研究首次阐明FOXK1/p-AKT/AKT轴在高糖诱导内皮损伤中的作用，为DR的靶向治疗提供了潜在新靶点。

研究同时指出存在一定局限性：HUVECs不能完全代表视网膜微血管；未检测FOXK1磷酸化状态；CCK-8主要反映代谢活性而非直接增殖率；缺乏LG条件下的FOXK1敲低组对比；未测定关键下游效应因子p-eNOS水平。未来需要采用视网膜血管内皮细胞和动物实验进一步验证，并深入探索FOXK1与其他信号通路的交互作用。

总之，该研究首次揭示FOXK1在高糖诱导内皮功能障碍中的关键作用及其通过p-AKT/AKT通路的分子机制，为开发DR新型治疗方法奠定了理论基础。