真菌苝醌类化合物的规模化生产及稳定同位素标记揭示其生物合成途径

本研究针对真菌苝醌类化合物（如竹红菌素和hypomycins）生产瓶颈问题，通过优化发酵培养基糖源添加策略，实现产量翻倍；结合13C标记葡萄糖示踪技术，首次证实糖类作为碳骨架直接参与苝醌生物合成，并开发绿色规模化制备工艺，为光动力疗法药物开发提供可持续生产方案。

　　

在微生物制药领域，真菌产生的苝醌类天然产物因其独特的光物理性质和显著生物活性备受关注。这类具有高度共轭结构的化合物（如竹红菌素hypocrellins和hypomycins）在光动力疗法中展现出巨大潜力，其对黑色素瘤细胞的半数有效浓度（EC₅₀）可达纳摩尔级别。然而，这类化合物的规模化生产始终面临挑战——传统化学合成方法步骤繁琐且难以放大，而真菌发酵产量低下又无法满足临床应用需求。

更令人困扰的是，苝醌类化合物的生物合成途径尚未完全明晰。虽然早期研究通过¹³C标记乙酸实验证实了乙酸单元可掺入苝醌骨架，但糖类作为潜在碳源的具体贡献机制仍属未知。这种认知空白直接限制了通过代谢工程手段提高产量的可能性。与此同时，现有提取工艺严重依赖氯仿等有害溶剂，既不符合绿色化学原则，也阻碍了产业化进程。

为了解决这些难题，研究人员在《Microbial Cell Factories》发表了创新性研究成果。他们采用多学科交叉方法，首先通过优化发酵条件显著提高产量，继而运用稳定同位素标记技术追踪碳源去向，最终开发出环境友好的规模化制备方案。

关键技术方法包括：利用Shiraia sp. (MSX60519)真菌菌株进行固态发酵；添加不同糖源（葡萄糖、果糖、蔗糖等）优化培养基；采用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRESIMS)进行化合物定性与定量分析；运用液滴探针质谱技术(droplet probe-MS)实现¹³C标记化合物的原位检测；通过核磁共振(NMR)验证同位素掺入情况；开发无卤代溶剂的绿色提取工艺。

Impact of different sugar substrates on the production of perylenequinones

研究人员首先探究了不同糖源对苝醌产量的影响。通过在燕麦培养基中添加等碳量的单糖（葡萄糖、果糖、木糖）和二糖（蔗糖、海藻糖），发现二糖 supplementation 使苝醌总产量实现倍增。其中蔗糖组ent-shiralachrome A(1)产量达到13.02±1.75 mg/g，显著高于对照组的7.22±0.16 mg/g。这种差异可能与二糖作为渗透调节物的功能及其特异性诱导葡萄糖苷水解酶表达有关。

Influence of sucrose concentrations on the production of perylenequinones

蔗糖浓度优化实验表明，产量随浓度增加呈先升后稳趋势。一倍蔗糖添加量（约250 mg/10 g燕麦）即可使产量翻番，而更高浓度则因碳分解代谢物抑制效应导致增长平台期。这表明适度提高糖浓度可增强碳可用性，但过量反而引发 osmotic stress（渗透胁迫）。

Stable isotope labeling experiments

¹³C标记葡萄糖喂养实验揭示了糖碳原子向苝醌骨架的直接转移。通过液滴探针质谱原位检测发现，ent-shiralachrome A(1)的[M+H]⁺离子m/z 547.1581出现一系列同位素峰，表明掺入了8-30个¹³C原子。最高丰度离子对应25个标记碳，占标记群体的30%。碎片分析显示乙酸丢失片段（Fragments 4和5）出现2单位质量偏移，证实标记碳掺入聚酮衍生区域。

NMR validation of isotope incorporation

¹³C-NMR谱显示标记样品中所有碳信号强度增强且出现广泛裂分，表明相邻¹³C原子间耦合作用。这一现象仅见于¹³C富集分子，确证了糖源碳原子直接掺入产物骨架，而非仅作为营养源。

Improving the purification of ent-shiralachrome A(1)

研究人员开发了环境友好的纯化方案，用丙酮-乙酸乙酯-水体系替代传统氯仿-甲醇提取，收率相当（95.3±12.8 mg vs 108.5±7.3 mg）但更绿色。通过重悬-离心沉淀技术，无需制备型HPLC即可获得>95%纯度的化合物1，极大提高了纯化效率。

Scaling up the semisynthesis of hypocrellin B(3)

以米培养基替代燕麦培养基简化产物谱，利用含化合物1和2的混合物直接进行碱催化脱水反应，经重悬-离心纯化后获得700 mg >95%纯度的hypocrellin B(3)，实现了克级规模制备。

本研究通过糖源优化、同位素示踪和工艺创新三方面突破，系统解决了苝醌类化合物生产中的关键问题。不仅首次证实糖类作为直接碳源通过聚酮合酶(PKS)途径和甲硫氨酸途径双通道掺入苝醌骨架，还建立了可持续的规模化生产平台。该工作为光敏剂药物的产业化奠定了基础，展示了代谢调控与绿色化学相结合在天然产物开发中的强大潜力。特别值得注意的是，液滴探针质谱技术的创新应用为微生物次级代谢研究提供了新的原位分析范式，这对未来研究真菌代谢网络具有重要启示意义。