基于转录组分析揭示桉树生长杂种优势的遗传基础：从可变剪接到核心基因的调控网络

《BMC Genomics》：Exploring the genetic basis of heterosis in eucalypt growth based on transcriptome analysis

为解决桉树人工林种质资源匮乏、抗逆性差及产量低等问题，研究人员开展了基于转录组测序的桉树生长杂种优势遗传机制研究。该研究通过比较生长优势杂交种18H167与劣势杂交种19H74及其亲本的基因表达谱，揭示了父本对杂种优势形成具有更大影响，并鉴定出6个关键通路及8个核心基因。研究还发现，外显子跳跃(SE)事件可能与生长劣势相关，而内含子保留(RI)事件则更可能与生长优势相关。该研究为桉树分子标记辅助育种提供了宝贵的遗传信息，并有望指导亲本选配。

　　

桉树，作为全球最重要的速生用材树种之一，在热带、亚热带乃至部分温带地区被广泛引种。然而，在中国桉树人工林中，长期存在大规模单一树种造林、品种退化、生产力下降及抗逆性减弱等突出问题。开发推广基因型丰富的优良桉树品种，是解决这些挑战的首要策略。在遗传改良中，杂种优势（Heterosis）——即杂交子一代在生长、繁殖、抗逆性等方面优于其亲本的现象——具有重要价值。尽管中国在桉树杂交育种及新品种选育方面已取得显著成果，但与农作物相比，林木杂种优势的分子遗传机制仍处于探索阶段，这主要归因于林木世代周期长、遗传背景复杂以及缺乏高效的分子育种技术。

为了揭示桉树生长杂种优势形成的遗传机制，Su Zhiyi等研究人员在《BMC Genomics》上发表了一项研究。该研究基于前期关于桉树杂种优势与亲本配合力关系的研究基础，选取了生长表现差异显著但亲缘关系相似的两个人工杂交种——生长优良的18H167（T15 × U3423）和生长较差的19H74（U3423 × U6）作为研究对象。通过转录组测序（RNA-seq）技术，研究人员系统分析了亲本与杂交种之间、以及两个杂交种之间的基因表达差异，旨在阐明桉树生长差异的遗传基础，为分子标记辅助育种提供理论依据。

关键实验方法

本研究主要采用了以下技术方法：

1. 1.
   实验设计与样本采集：选取生长表现差异显著的两个杂交种（18H167和19H74）及其三个亲本（T15、U3423、U6）作为研究对象，每个基因型采集3个生物学重复的叶片组织。
2. 2.
   转录组测序与数据分析：利用RNA-seq技术对样本进行测序，通过Fastp进行质量控制，使用HISAT2将测序数据比对至参考基因组，并利用StringTie进行转录本组装和基因表达量（FPKM）计算。
3. 3.
   差异表达与富集分析：使用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）筛选，并利用GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行功能富集分析，同时采用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）进行基因集富集分析。
4. 4.
   可变剪接（AS）分析：利用rMATS软件识别和分析样本间的差异可变剪接事件。
5. 5.
   加权基因共表达网络分析（WGCNA）：构建基因共表达网络，识别与生长性状显著相关的基因模块及核心基因（Hub genes）。
6. 6.
   蛋白质互作（PPI）网络分析：利用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质互作网络，筛选关键靶基因。

研究结果

样本关系分析

主成分分析（PCA）结果显示，两个杂交种（H167和H74）各自紧密聚类，且与亲本在转录组水平上存在明显分离。H167在PCA图上更靠近其父本U3423，而H74则与其父本U6的相关性更高，这初步表明父本对杂交种生长杂种优势的形成具有更大的影响。

富集分析

通过GO、KEGG和GSEA富集分析，研究人员鉴定出6个与桉树生长杂种优势相关的关键基因集，包括“胞外区（extracellular region）”、“外部包被结构（external encapsulating structure）”、“细胞周缘（cell periphery）”、“大核糖体亚基（large ribosomal subunit）”、“核糖体亚基（ribosomal subunit）”以及“剪接体（Spliceosome）”。此外，在“植物-病原互作（Plant-pathogen interaction）”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）”通路中，鉴定出CDPK、CaMCML、EDS1、MPK3/6、RPS2、TAT、ARO8、LSM、SF3a和eIF3等关键差异表达基因产物。

可变剪接（AS）分析

分析发现，两个杂交种的可变剪接事件数量均显著高于其亲本。在两种杂交种中，外显子跳跃（Skipped Exon, SE）和内含子保留（Retained Intron, RI）是最常见的两种事件类型。在生长较差的杂交种H74与其父本U6的比较中，SE事件数量最高；而在两个杂交种H167与H74的比较中，RI事件数量相对较高。这表明SE事件可能与生长劣势相关，而RI事件则更可能与生长优势相关。

WGCNA分析

通过构建加权基因共表达网络，研究人员发现tan模块与桉树生长性状（如树高、胸径等）具有最强的相关性。从该模块中鉴定出MSTRG.35,350、MSTRG.4104和ncbi_104443483等核心基因。此外，在tan模块中显著富集的KEGG通路包括“半乳糖代谢（Galactose metabolism）”，其中2.4.1.123和2.4.1.82蛋白在H74中相对于H167显著上调。

靶基因筛选

综合上述分析结果，研究人员共筛选出8个核心基因，包括ncbi_104422945、MSTRG.35,350、MSTRG.4104、ncbi_104443483、ncbi_104448375、ncbi_104440165、ncbi_104434572以及转录因子ncbi_104452186。通过蛋白质互作（PPI）网络分析，进一步确定了这些基因在调控网络中的中心地位。

研究结论与讨论

本研究通过整合转录组测序、差异表达分析、WGCNA、可变剪接分析及蛋白质互作网络分析等多种生物信息学手段，系统揭示了桉树生长杂种优势的遗传基础。研究结果表明，父本在杂种优势形成中扮演了关键角色，这一发现为桉树杂交育种中亲本选配策略提供了重要指导。

研究鉴定出的6个关键通路和8个核心基因，为后续功能验证和分子标记开发提供了候选靶点。其中，胞外区、核糖体亚基等细胞组分相关通路的富集，提示了细胞组分在调控生长杂种优势中的重要性。而植物-病原互作、剪接体等通路的参与，则暗示了抗逆性与生长优势之间的紧密联系。

特别值得注意的是，本研究首次在桉树中揭示了可变剪接事件与生长杂种优势的关联。研究推测，外显子跳跃（SE）可能导致功能丧失性突变，从而引发无义介导的mRNA降解，造成能量消耗和生长受损；而内含子保留（RI）则可能通过整合内含子调控元件，产生调控性非编码RNA或功能获得性异构体，从而促进环境适应性。这种“剪接介导的突变缓冲”机制，可能是桉树在自然选择压力下维持遗传稳定性和表型可塑性的重要策略。

综上所述，本研究不仅为桉树杂种优势的分子机制提供了新的见解，还开发了用于筛选差异基因通路的Python代码，为加速林木遗传育种研究提供了高效工具。这些发现有望指导桉树优良亲本的选配，并为桉树基因组注释和分子标记辅助育种提供宝贵的遗传信息。