森林草莓PLCP基因家族响应灰霉菌胁迫的鉴定与表达分析揭示植物免疫新机制

本研究针对植物如何应对灰霉菌（Botrytis cinerea）侵染的机制问题，系统开展了森林草莓（Fragaria vesca）中木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（PLCP）基因家族的鉴定与功能分析。研究人员通过进化树分析鉴定出44个FvPLCP基因，并利用单细胞转录组和双重转录组技术揭示了该家族成员在灰霉菌侵染早期的细胞特异性表达模式及与激素通路的关联。实验证实FvSAG12通过调控水杨酸（SA）途径正调控草莓抗病性。该研究为解析PLCP在植物免疫中的作用提供了理论依据，对罗科作物抗病育种具有重要指导意义。

　　

植物在整个生长周期中面临着多种生物和非生物胁迫的挑战，其中真菌病原体如灰霉菌（Botrytis cinerea）导致的病害严重影响着作物的产量和质量。为了应对这些入侵，植物进化出了复杂的免疫防御系统，而木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（Papain-like cysteine proteases, PLCPs）作为植物免疫系统的核心组成部分，在防御反应中发挥着关键作用。尽管PLCP基因家族在拟南芥、水稻等模式植物中已有较深入的研究，但在蔷薇科作物尤其是森林草莓（Fragaria vesca）中的功能仍知之甚少。森林草莓因其基因组紧凑、二倍体特性以及遗传操作便利性，成为研究蔷薇科作物的理想模型。因此，解析森林草莓中PLCP基因家族的组成、进化及在灰霉菌胁迫下的响应机制，对于提高作物抗病性及育种实践具有重要的科学意义。本研究发表在《BMC Plant Biology》，系统鉴定了森林草莓中的PLCP基因家族，并深入探究了其在灰霉菌侵染过程中的表达模式和功能。

为开展本研究，作者运用了多种关键技术方法：首先利用HMMER和SMART工具进行全基因组范围内的PLCP基因鉴定与结构验证；通过最大似然法构建系统进化树对基因进行亚家族分类；采用MEME和GSDS进行保守基序和基因结构分析；运用MapChart进行染色体定位及复制事件分析；基于单细胞转录组（scRNA-seq）和双重RNA测序（dual-RNAseq）技术解析基因在灰霉菌侵染早期的时空表达动态；通过RT-qPCR验证基因表达模式；利用草莓果实瞬时过表达和基因沉默技术验证关键基因功能。实验所用森林草莓材料“Hawaii4”保存于南京农业大学实验室，灰霉菌侵染样本队列包括0-12小时不同时间点及不同细胞类型。

Genome-wide identification of FvPLCP genes in woodland strawberry

通过HMM搜索Peptidase_C1结构域（PF00112.26），本研究在森林草莓基因组中共鉴定出44个FvPLCP基因。蛋白质理化性质分析表明，这些蛋白的等电点介于4.47至9.33之间，分子量范围为17.68至57.99 kDa，大多数为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示它们主要分布于细胞外基质、叶绿体、细胞核等部位。系统进化分析将FvPLCPs与拟南芥和水稻的PLCPs一起划分为9个亚家族：RD21、CEP、XCP、XBCP、THI、SAG12、RD19、ALP和CTB，表明它们可能承担不同的生物学功能。

Gene structure, and conserved motif analysis of the FvPLCP genes

基因结构和保守基序分析揭示了FvPLCPs的高度保守性。所有成员均包含Peptidase_C1结构域（motif 1-5），而SAG12亚家族特有motif 12（Granulin），RD19亚家族特有motif 14（Papain-like-cys-pep-sf）。基因结构分析显示不同亚家族的内含子数量存在显著差异，从THI亚家族的单个内含子到CTB亚家族的十个内含子不等，这进一步支持了功能分化的可能性。

Chromosomal location and expansion of FvPLCP genes

染色体定位分析表明44个FvPLCP基因不均匀分布在7条染色体上，其中Fvb1、Fvb3和Fvb7分布最多（各8个），而Fvb5分布最少（仅3个）。基因复制事件分析发现分散重复（dispersed duplication）是基因家族扩张的主要方式（占78.33%）。Ka/Ks比值分析表明所有重复基因对均经历纯化选择（比值0-0.55），说明FvPLCP基因在进化过程中主要受到功能约束。

Cis-element analysis of promoter regions in FvPLCP genes

启动子顺式作用元件分析发现，FvPLCP基因启动子区域包含496个元件，主要涉及激素响应、厌氧诱导、防御与胁迫响应、低温响应、干旱诱导和光响应等，表明这些基因可能广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应过程。

Co-expression network of FvPLCP families with hormone-related genes

共表达网络分析显示，17个FvPLCPs与31个激素相关基因之间存在69条共表达边，其中FvH4_2g38940、FvH4_2g38850和FvH4_2g33910连接度最高（各10条边），表明它们可能是激素调控网络中的枢纽基因。正负调控关系的存在提示PLCPs可能通过复杂网络参与激素信号转导。

Tissue-specific expression analysis of the FvPLCP genes

组织特异性表达分析显示，FvPLCP基因在花药、叶片、花柱、胚、花粉、心皮、幼苗和根等器官中高表达，表明它们可能参与草莓的生长发育过程。

Transcriptome and RT-qPCR analysis of FvPLCP genes and hormone related genes during B. cinerea infection

通过整合单细胞转录组和双重RNA测序数据，研究人员揭示了FvPLCP基因在灰霉菌侵染早期的时空表达模式。THI和SAG12亚家族成员在侵染早期（0.5-3 hpi）高表达，而RD21、CTB、CEP、XBCP、ALP和RD19亚家族成员在后期（7-12 hpi）高表达。RT-qPCR验证了这些表达趋势，并发现激素相关基因（如SA途径的FaDIR6）与特定FvPLCPs（如FvSAG12）表达模式相似，表明PLCPs可能通过SA、JA和ET激素信号通路参与免疫响应。单细胞转录组分析进一步显示，不同FvPLCPs在不同细胞类型（如 hydathode细胞、叶肉细胞、上表皮细胞和韧皮部细胞）中特异性表达，揭示了细胞类型特异性的防御机制。

FvSAG12 gene positively regulates the response process of strawberry to B.cinerea

功能验证实验表明，瞬时过表达FvSAG12的草莓果实对灰霉菌的抗性显著增强，病斑面积减少64%，同时SA途径关键基因FaDIR6表达上调10.36倍，证实了FvSAG12通过正调控SA信号通路增强植物抗病性。

讨论

本研究首次在森林草莓中全基因组范围内鉴定了PLCP基因家族，并系统解析了其在灰霉菌胁迫下的表达模式和功能。结果表明，FvPLCP基因家族在进化上高度保守，并通过纯化选择维持功能稳定性。不同亚家族成员在灰霉菌侵染过程中表现出时空表达特异性，且与激素信号通路密切相关。功能实验证实FvSAG12通过调控SA途径正调控抗病性。这些发现不仅丰富了植物免疫机制的理论基础，而且为蔷薇科作物的抗病育种提供了重要的基因资源和理论指导。未来的研究可进一步探索PLCPs在免疫信号转导中的具体分子机制及其在作物改良中的应用潜力。