miR-34/449通过Wnt/β-catenin通路调控输卵管纤毛细胞分化的新机制及其在不孕症中的作用

《Cell & Bioscience》：The miR-34/449 clusters regulate the differentiation of ciliated cells in the oviduct via the Wnt/β-catenin signaling pathway

本研究针对输卵管上皮稳态调控机制不明的难题，聚焦miR-34/449簇对纤毛细胞分化的调控作用。通过构建miR-34b/c-/-;miR-449-/-双敲除（miR-dKO）小鼠模型，结合输卵管类器官培养体系，发现miR-34/449缺失导致Wnt/β-catenin信号通路过度激活，关键靶点Dvl2上调，进而抑制分泌细胞向纤毛细胞分化，最终引起小鼠不孕。该研究首次揭示miRNA-Wnt通路轴在输卵管上皮稳态维持中的核心作用，为输卵管相关不孕症提供了新的治疗靶点。

　　

在女性生殖系统中，输卵管扮演着不可或缺的角色，它是卵子与精子相遇的桥梁，也是早期胚胎发育的温床。输卵管上皮由分泌细胞和纤毛细胞精密配合，纤毛细胞的规律摆动如同传送带，确保卵子和胚胎的顺畅运输。然而，当这种精密平衡被打破时，不孕、异位妊娠甚至肿瘤等疾病便接踵而至。尽管输卵管上皮稳态如此重要，其调控机制却仍是未解之谜，尤其是微观层面的调控网络——microRNA（ miRNA）如何参与这一过程，更是研究甚少。

在这项发表于《Cell & Bioscience》的研究中，吴琪倩等研究人员将目光投向了miR-34/449这一 miRNA家族。此前的研究表明，这个家族的成员在呼吸道、脑室等多种组织的运动纤毛发生中扮演着关键角色，但它们是否以及如何调控输卵管纤毛细胞的分化，仍是一个悬而未决的问题。为了回答这个问题，研究人员展开了一项多层次、系统性的探索。

研究人员首先确认了miR-34/449在输卵管中的表达模式，发现其表达水平与纤毛细胞的数量呈显著正相关，提示它们可能参与了纤毛细胞的发育。为了验证这一假设，研究团队使用了之前构建的miR-34b/c^-/-;miR-449^-/-双敲除（miR-dKO）小鼠模型。结果发现，成年雌性miR-dKO小鼠完全丧失了生育能力。深入探究发现，其不孕的根源在于输卵管伞部（远端）的纤毛细胞数量急剧减少，而分泌细胞则异常增多，导致卵子无法被正常拾取，滞留于卵巢囊内。这一表型在小鼠出生后三周便开始显现，此时正是输卵管纤毛细胞大量分化的关键时期。

那么，miR-34/449的缺失是如何导致纤毛细胞分化障碍的呢？研究团队分离了小鼠输卵管上皮细胞进行转录组测序（RNA-seq）。分析结果指向了一个明确的信号通路——Wnt/β-catenin信号通路在miR-dKO小鼠的输卵管上皮中出现了异常激活。基因集富集分析（GSEA）显示，Wnt通路被显著激活，而Notch和Hedgehog等其他与纤毛发生相关的通路则未发生明显变化。进一步的生物信息学分析和实验验证将目标锁定在了Dvl2（Dishevelled 2）上，它是Wnt通路中的一个关键信号转导分子。双荧光素酶报告基因实验证实，Dvl2的3‘UTR（非翻译区）上存在miR-34/449的结合位点，是miR-34/449的直接靶标。在miR-dKO小鼠中，由于失去了miR-34/449的抑制，Dvl2表达上调，进而导致了Wnt/β-catenin通路的过度激活。

为了在功能上验证这一机制，研究人员建立了一套输卵管上皮类器官培养体系。他们发现，来自miR-dKO小鼠的类器官生长更快、体积更大，但其中的纤毛细胞比例却显著降低，完美复刻了体内的表型。当在培养体系中加入Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939或NSC668036后，类器官的异常生长得到抑制，纤毛细胞的分化缺陷被完全挽救，纤毛细胞的数量恢复到接近正常水平。更有趣的是，特异性敲低Dvl2也能部分逆转miR-dKO类器官的表型，虽然效果不如通路抑制剂彻底，但同样显著促进了纤毛细胞的分化。反之，在正常小鼠的输卵管上皮类器官中过表达Dvl2，则能模拟出miR-dKO的表型，导致纤毛细胞分化受阻，而这一效应可被外源添加的miR-34/449模拟物所逆转。

主要技术方法

本研究综合利用了基因敲除小鼠模型、组织学与免疫荧光染色、透射电镜、输卵管上皮与基质层分离技术、蛋白质印迹（Western blot）、RNA-seq转录组学分析、基因集富集分析（GSEA）、双荧光素酶报告基因 assay、原代输卵管上皮细胞二维培养以及三维输卵管上皮类器官培养与遗传操作（如shRNA敲低和过表达）等关键技术方法。类器官模型成功模拟了体内输卵管上皮的生物学特性，为机制研究提供了理想平台。

研究结果

MiR-34/449簇的表达与输卵管纤毛细胞发育正相关

研究人员首先通过酶消化和机械分离法成功分离了野生型小鼠输卵管的 epithelial layer（上皮层）和 stromal layer（基质层），并证实miR-34/449主要在上皮层中高表达。免疫荧光染色显示，输卵管远端（伞部和壶腹部）的纤毛细胞数量随小鼠周龄增加而增加，至8周时达到顶峰（约占上皮细胞的80%），且其数量始终高于近端（峡部和宫管连接部）。与此一致，miR-34/449的表达水平也随周龄增长而升高，并且在远端输卵管中的表达显著高于近端。这些结果表明，miR-34/449的表达与纤毛细胞的丰度密切相关。

miR-dKO雌鼠不孕与纤毛细胞减少

对miR-dKO雌鼠的繁殖表型分析证实其完全不孕。虽然其激素水平和卵泡发生正常，但排卵后，卵丘-卵母细胞复合物（COCs）被困在卵巢囊内，无法进入输卵管壶腹部。这表明不孕源于输卵管伞部拾卵功能失效。

miR-dKO小鼠输卵管纤毛细胞减少始于出生后三周

通过对不同周龄小鼠输卵管的动态观察，研究人员发现，在miR-dKO小鼠输卵管远端，纤毛细胞数量的显著减少和分泌细胞数量的增加始于出生后三周。同时，处于分泌细胞向纤毛细胞分化过渡状态的中间细胞（PAX8⁺/Ac-α-tubulin⁺）数量也显著减少，提示分化过程受阻。透射电镜结果进一步证实了纤毛细胞减少、基体数量下降和纤毛排列紊乱。而在输卵管近端，各类细胞比例则无显著差异。细胞增殖与凋亡检测表明，纤毛细胞的减少并非由于凋亡增加，而是因为分泌细胞（Ki67⁺/PAX8⁺）过度增殖，未能正常退出细胞周期并分化为纤毛细胞。

miR-dKO小鼠输卵管上皮中Wnt/β-catenin信号通路过度激活

对3周龄小鼠输卵管上皮的RNA-seq分析揭示了1539个差异表达基因（DEGs），其中930个上调，609个下调。GSEA分析明确指出Wnt/β-catenin信号通路在miR-dKO组中异常激活，而Notch和Hedgehog通路则无显著变化。qRT-PCR和Western blot验证了Wnt通路激活相关分子（如β-catenin）的上调。利用TOPflash/FOPflash报告系统检测Wnt通路活性，证实其在miR-dKO小鼠输卵管远端上皮中显著升高。通过生物信息学预测和实验验证，研究人员将目标锁定在Dvl2上，证实其是miR-34/449的直接靶标。

Wnt/β-catenin信号通路抑制剂挽救miR-dKO类器官的纤毛分化缺陷

利用BET培养基（不含外源Wnt激动剂）培养的输卵管上皮类器官成功再现了miR-dKO小鼠体内的表型：类器官生长更快、更大，但纤毛细胞（Ac-α-tubulin⁺）比例显著降低。加入Wnt通路抑制剂XAV-939（通过促进β-catenin降解抑制通路）或NSC668036（通过结合Dvl2的PDZ结构域抑制信号转导）后，miR-dKO类器官的生长受到抑制，其纤毛细胞分化缺陷被完全挽救，纤毛细胞数量和相关分子标志物表达均恢复至接近对照组水平。

敲低Dvl2部分挽救miR-dKO类器官的纤毛分化缺陷

为了直接验证Dvl2的作用，研究人员使用慢病毒介导的shRNA在miR-dKO类器官中敲低Dvl2的表达。结果显示，敲低Dvl2后，类器官的过度生长受到抑制，纤毛细胞数量有所增加，Wnt通路活性下降，但未能完全恢复到对照组水平，表明敲低Dvl2只能部分逆转miR-dKO的表型。这可能是由于Dvl2的敲低效率不完全，或其他miR-34/449的潜在靶点（如Lef1, Tbl1xr1）也参与了调控。

过表达Dvl2可模拟miR-dKO表型并被miR-34/449模拟物逆转

在对照组类器官中过表达Dvl2，可以模拟出miR-dKO的表型：类器官生长加速，纤毛细胞分化受阻。而当同时加入miR-34/449模拟物时，这一异常表型则被有效逆转，纤毛细胞数量得以恢复。这进一步证实了miR-34/449通过靶向Dvl2来调控Wnt通路活性和纤毛细胞分化的因果关系。

结论与意义

本研究系统阐明了miR-34/449簇在维持输卵管上皮稳态中的关键作用及其分子机制。研究发现，miR-34/449通过直接靶向Wnt/β-catenin信号通路的关键分子Dvl2，负向调控该通路的活性。当miR-34/449缺失时，Dvl2表达上调，导致Wnt通路过度激活，进而抑制了分泌细胞向纤毛细胞的分化过程，最终造成输卵管远端纤毛细胞缺失和雌鼠不孕。该研究不仅揭示了miRNA调控输卵管生物学功能的一个全新机制，而且首次将miR-34/449-Dvl2-Wnt/β-catenin轴确立为输卵管上皮细胞命运决定的关键调控枢纽。

这项研究的发现具有重要的理论意义和潜在的临床价值。在理论上，它深化了我们对microRNA在生殖道上皮稳态维持中作用的理解，为研究其他多纤毛器官（如呼吸道）的发育和疾病提供了新的视角。在临床转化方面，该研究为输卵管性不孕症（例如因纤毛功能障碍所致）的病因诊断提供了新的分子标记（如miR-34/449表达水平或Dvl2活性），同时也提示Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可能成为治疗此类疾病的一种潜在策略。此外，研究所建立的输卵管类器官模型为后续高通量药物筛选和疾病建模提供了强大的平台。