肿瘤坏死因子通过上调双皮质素样激酶1表达驱动肠上皮细胞重编程与癌变的新机制

本研究聚焦慢性炎症如何促进结直肠癌（CRC）发生这一关键科学问题，揭示了肿瘤坏死因子（TNF）通过TNFRSF1A/NF-κB/c-Myc轴上调双皮质素样激酶1（DCLK1）表达，诱导肠上皮细胞重编程、上皮-间质转化（EMT）和癌干细胞（CSC）特性获得，最终导致肿瘤转化。该发现为炎症相关结直肠癌的防治提供了新的潜在靶点。

　　

在医学研究领域，慢性炎症与癌症的发生发展一直存在着千丝万缕的联系，尤其是对于炎症性肠病（IBD）患者而言，其罹患结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的风险显著增高，这种特定类型被称为结肠炎相关结直肠癌（Colitis-Associated Colorectal Cancer, CA-CRC）。尽管治疗和监测手段的进步使得发病率有所下降，但慢性炎症究竟如何一步步促发癌变，其深层的细胞与分子机制仍笼罩在迷雾之中，是科学家们致力破解的重大难题。

肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）作为一种核心的炎症因子，在IBD和CA-CRC的病理进程中扮演着关键角色。然而，长期的TNF暴露是否以及如何直接导致正常细胞走向癌变，仍然是一个未被完全阐明的谜题。另一方面，癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）被认为是肿瘤发生、耐药、复发和转移的“罪魁祸首”，但它们的起源同样众说纷纭。近年来，一种名为双皮质素样激酶1（Doublecortin-like kinase 1, DCLK1）的蛋白吸引了研究人员的注意。它不仅是肠道簇细胞（tuft cell）的标志物，更被发现在结直肠癌和胰腺癌的CSCs中高度表达，与不良预后密切相关。DCLK1能促进上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT），增强干细胞特性，但其在慢性炎症的微环境中是如何被调控的，又与TNF这样的核心炎症因子有何互动，是理解炎症向癌症转化的关键一环。

为了回答这些问题，由Lin Huang、Tianqi Li、Xingmin Wang等研究人员组成的研究团队在《Cell Communication and Signaling》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项多层次、系统性的研究，旨在揭示TNF是否通过调控Dclk1的表达，进而驱动肠上皮细胞的重编程和恶性转化，最终阐明了慢性炎症驱动肠道CSCs产生和CRC发展的新机制。

研究者们为完成这项研究，综合运用了多种关键技术方法。研究体系涵盖了从体外细胞模型（大鼠肠上皮细胞系IEC-6）、到体内转基因动物模型（人源TNF转基因小鼠、Tnfrsf1a^-/-基因敲除小鼠），再到离体类器官培养（源自小鼠结肠隐窝）的多层次实验平台。关键技术包括：利用shRNA进行基因沉默（Knockdown）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和定量实时PCR（qRT-PCR）进行分子表达水平检测；免疫荧光（IF）染色和流式细胞术（FACS）进行蛋白定位和阳性细胞计数；转录因子活性分析芯片筛选关键调控因子；单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行细胞图谱解析和发育轨迹重构；以及免疫缺陷鼠（NOD/Scid小鼠）异种移植瘤实验评估体内成瘤能力。对人类样本数据的生物信息学分析则主要基于TCGA数据库，利用OncoDB、GEPIA2等在线工具进行相关性、生存分析和信号通路富集分析（GSEA）。

研究结果

Dclk1表达在TNF人源化小鼠中上调

研究人员首先在过表达人TNF的转基因小鼠模型中观察到了肠道形态的早期改变，包括增生和杯状细胞减少。与野生型（WT）小鼠相比，TNF转基因小鼠的结肠和小肠中不仅人TNF基因表达显著升高，增殖细胞核抗原（Pcna）阳性细胞增多，而且Dclk1的mRNA和蛋白水平也显著上调，表明TNF的过表达足以在体内诱导Dclk1的表达。

TNF在肠上皮细胞中诱导Dclk1表达

通过对人类TCGA数据库的分析，研究人员发现DCLK1的表达与炎症反应信号、TNF水平以及TNF受体TNFRSF1A均呈显著正相关，且高DCLK1表达预示着更差的疾病无生存期。在体外实验中，用TNF处理大鼠肠上皮细胞IEC-6后，Dclk1的表达随时间（24-72小时）显著增加，其中短亚型Dclk1-S（~47 kDa）的反应尤为明显。流式细胞术和免疫荧光染色均证实，TNF处理导致了Dclk1阳性细胞比例的显著升高，而抗Tnfrsf1a抗体可以阻断这一效应，提示TNF通过其受体调控Dclk1。

TNF通过Tnfrsf1a诱导Dclk1表达

为了确认TNF信号通路的具体作用机制，研究人员沉默了IEC-6细胞中的Tnfrsf1a基因。结果显示，Tnfrsf1a的敲低显著降低了TNF所诱导的Dclk1表达。在动物实验中，给野生型小鼠注射TNF可显著增加小肠中Dclk1阳性细胞的数量，但在Tnfrsf1a基因敲除（Tnfrsf1a^-/-）小鼠中，TNF处理则无法引起Dclk1阳性细胞的增加。这些证据强有力地表明，TNF主要通过TNFRSF1A受体来上调Dclk1的表达。

TNF通过激活干细胞转录因子诱导Dclk1表达

进一步的机制探索发现，TNF处理能激活IEC-6细胞中多个关键的干细胞相关转录因子，包括NF-κB、c-Myc、Oct3/4等。生物信息学分析提示大鼠Dclk1基因启动子区存在NF-κB结合 motif。功能实验证实，使用NF-κB抑制剂（Bay-11-7082）或c-Myc抑制剂（10074-G5）处理，均能显著抑制TNF诱导的Dclk1表达，且两者联用表现出协同抑制效应。这表明TNF通过激活NF-κB和c-Myc等转录因子来正向调控Dclk1的表达。

TNF促进结肠类器官生长

类器官模型是研究干细胞特性的理想体外体系。研究人员发现，源自TNF转基因小鼠的结肠类器官，其数量和大小均显著大于野生型小鼠来源的类器官。外源性TNF处理也能促进野生型类器官中Dclk1阳性细胞的增加。相反，源自Tnfrsf1a^-/-小鼠的类器官则表现出生长受损，且TNF处理无法挽救其缺陷。这证明TNF-Tnfrsf1a信号对于维持肠道干细胞的干性和增殖能力至关重要。

长期暴露于TNF诱导重编程和干性获得

为了模拟慢性炎症环境，研究人员对IEC-6细胞进行了长达10轮的长期TNF暴露（IEC-6TNF），并建立了稳定细胞系。与对照组（IEC-6Ctrl）相比，IEC-6TNF细胞中Dclk1表达持续稳定升高。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现，长期TNF处理彻底改变了细胞的组成格局：对照细胞包含杯状细胞、簇细胞、短暂扩增（TA）细胞和肠细胞等多种分化细胞类型；而TNF处理的细胞中，分化细胞（如杯状细胞和肠细胞）大量减少，取而代之的是干细胞簇（占23%）的显著出现。伪时间轨迹分析显示，在TNF存在的背景下，细胞的发育轨迹从TA细胞流向簇细胞，并最终产生了干细胞，表明Dclk1阳性的簇细胞发生了去分化和重编程，获得了干细胞特性。

TNF导致EMT和肿瘤性转化

基因集富集分析（GSEA）显示，长期TNF处理显著富集了与结直肠癌、多能性调控、TNF信号、NF-κB信号以及上皮-间质转化（EMT）等相关的通路。Western Blot验证了IEC-6TNF细胞发生了典型的EMT改变：E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下降，而N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达上升。最关键的证据来自体内成瘤实验：将IEC-6TNF细胞注射到免疫缺陷的NOD/Scid小鼠体内后，在10个注射位点中的6个形成了肿瘤；而注射对照IEC-6Ctrl细胞的位点则无一成瘤。对肿瘤组织的鉴定证实其来源于大鼠IEC-6细胞，并且组织学分析显示大部分肿瘤呈现肉瘤样形态，强表达Vimentin和Dclk1，进一步证实了TNF处理所诱导的EMT和恶性转化。

结论与意义

本研究系统性地揭示了慢性炎症核心因子TNF驱动肠道癌变的一条完整通路：TNF通过其受体TNFRSF1A激活下游NF-κB和c-Myc等干细胞转录因子，进而显著上调癌症干细胞标志物Dclk1（特别是Dclk1-S亚型）的表达。长期暴露于TNF的炎症环境会诱导肠上皮细胞发生深刻的命运改变，促使Dclk1阳性的簇细胞去分化和重编程，获得干细胞特性，并激活与结直肠癌发生、EMT相关的多条信号通路，最终导致细胞发生恶性转化，在体内形成肿瘤。

该研究的重大意义在于：首先，它直接证明了长期的炎症刺激（以TNF为代表）本身足以作为癌变的始动因素，而不仅仅是“促进者”。其次，它清晰地揭示了Dclk1阳性细胞作为炎症向癌症转化过程中的关键节点，为理解癌症干细胞的起源提供了新的视角——它们不仅可以来源于正常的干细胞，还可以由已分化的细胞通过炎症介导的重编程“创造”出来。最后，该研究明确了TNF-TNFRSF1A-NF-κB/c-Myc-DCLK1信号轴在CA-CRC中的核心地位，为开发针对此通路的新型干预策略（例如利用DCLK1抑制剂或抗TNF疗法预防癌变）提供了坚实的理论依据和极具潜力的治疗靶点，对于防治炎症相关结直肠癌具有重要的 translational（转化）价值。