基于单细胞测序与生物信息学整合分析揭示胶质瘤关键生物标志物、免疫微环境特征及槲皮素的治疗潜力

《Hormones & Cancer》：Identification of key biomarkers and immune microenvironment features in gliomas based on single-cell analysis combined with bioinformatics

本研究针对胶质瘤高度异质性及治疗挑战，通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)与生物信息学分析，系统揭示了肿瘤微环境中10种细胞亚群的分布特征，鉴定出DLGAP5、TOP2A、CHEK1、MKI67等20个关键基因。研究发现这些基因显著富集于p53信号通路、细胞周期等核心通路，并通过分子 docking 证实天然化合物槲皮素(Quercetin)可有效靶向上述关键蛋白。体外实验进一步验证槲皮素能显著抑制U87MG细胞活力并下调靶蛋白表达，为胶质瘤靶向治疗提供新策略。

　　

作为中枢神经系统中最具侵袭性的原发性肿瘤，胶质瘤以其极高的异质性和侵袭性成为临床治疗的重大挑战。尽管手术、放疗和化疗技术不断进步，但胶质母细胞瘤(GBM)患者的生存期仍普遍短于两年。这种治疗困境主要源于肿瘤细胞的高度异质性、复杂的免疫微环境以及传统疗法的耐药性。特别是在肿瘤微环境中，小胶质细胞、星形胶质细胞等免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，形成了免疫抑制环境，帮助肿瘤实现免疫逃逸。深入解析胶质瘤的细胞组成特征和分子机制，成为开发新型治疗策略的关键突破口。

近年来，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的突破为研究肿瘤异质性提供了革命性工具。通过在高通量水平分析单个细胞的基因表达谱，研究人员能够精确识别肿瘤组织中的不同细胞类型，揭示细胞状态转变的动态过程。同时，生物信息学方法能够从海量基因表达数据中挖掘关键基因和信号通路，为理解疾病机制提供系统视角。将这两种技术有机结合，有望全面揭示胶质瘤的发病机制并发现新的治疗靶点。

本研究整合单细胞测序与多组学分析，旨在系统揭示胶质瘤的细胞异质性、免疫微环境特征及关键分子机制。研究人员从GEO数据库获取基因表达数据集GSE50161（包含34例胶质瘤和13例正常脑组织样本），通过差异表达分析鉴定394个差异表达基因(DEGs)。采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建基因模块，识别与胶质瘤最相关的基因集合。结合GeneCards数据库筛选胶质瘤相关基因，利用STRING数据库构建蛋白质相互作用(PPI)网络，通过CytoHubba插件识别核心基因。同时，使用CIBERSORT算法评估免疫细胞浸润特征。单细胞数据分析基于GSE276177数据集，经过质控、批次校正和细胞聚类后，鉴定出11种细胞亚群。通过CellMarker和PanglaoDB数据库进行细胞注释，利用CytoTRACE算法进行细胞轨迹分析。功能富集分析采用GO和KEGG数据库，分子对接使用AutoDock Vina软件，实验验证包括CCK-8法检测细胞活力和Western blot分析蛋白表达。

差异表达基因鉴定与关键模块筛选

通过Limma差异分析发现394个显著差异表达基因，其中104个上调、290个下调。WGCNA分析确定软阈值β=8时构建尺度无关网络，识别13个共表达模块，其中蓝色模块与胶质瘤相关性最高（相关系数=0.83）。该模块包含798个基因，基因显著性与模块成员性呈正相关（r=0.52），提示这些基因在胶质瘤中具有重要功能。

核心基因筛选与免疫浸润特征

整合WGCNA模块基因、DEGs和GeneCards数据，获得37个交集基因。PPI网络分析显示这些基因存在密切相互作用，通过节点中心性分析筛选出前20个关键基因，并进一步确定CHEK1、DLGAP5、MKI67、TOP2A为顶级核心基因。免疫浸润分析发现巨噬细胞、B细胞、T滤泡辅助细胞(Tfh)、Th2细胞和自然杀伤(NK)细胞与胶质瘤发生发展密切相关。比较分析显示CD8⁺初始T细胞、Tr1细胞、Th1细胞、诱导性调节T细胞(iTreg)和中央记忆T细胞在胶质瘤与正常组织间分布存在显著差异。

功能富集分析揭示关键通路

GO分析显示20个关键基因显著富集于296个功能条目，包括有丝分裂中心体分离调控、p53介导的信号通路调控、染色体分离、微管运动等生物过程，以及动粒结合、组蛋白激酶活性等分子功能。KEGG通路分析发现这些基因主要参与p53信号通路、细胞周期、卵母细胞减数分裂和马达蛋白等58条信号通路。p53信号通路作为核心通路，在胶质瘤发生发展中发挥关键作用。

单细胞解析胶质瘤细胞异质性

单细胞数据分析鉴定出11个细胞亚群：抑制性神经元、癌细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、增殖性癌细胞、兴奋性神经元、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、小胶质细胞、T细胞和少突胶质细胞。细胞轨迹分析显示少突胶质细胞处于分化关键节点，可能在胶质瘤进展中起重要作用。细胞比例分析发现胶质瘤组中T细胞、增殖性癌细胞和抑制性神经元比例显著增加，而少突胶质细胞、星形胶质细胞和TAM比例下降。基因表达分析显示CHEK1、DLGAP5、MKI67和TOP2A主要在增殖性癌细胞中高表达，这些基因与细胞周期调控、DNA复制和染色体分离密切相关。

槲皮素的靶向治疗潜力验证

分子对接结果显示槲皮素与四个核心靶点（CHEK1、DLGAP5、MKI67、TOP2A）均具有强结合能力（结合能<-5kJ/mol）。体外实验表明槲皮素以浓度依赖方式抑制U87MG细胞活力，100μM浓度下抑制率约50%。Western blot验证槲皮素处理可显著下调上述靶蛋白表达，提示其通过干预细胞周期和增殖相关通路发挥抗胶质瘤作用。

本研究通过多组学整合分析系统揭示了胶质瘤的细胞异质性和免疫微环境特征，不仅识别了关键致病基因和信号通路，还验证了天然化合物槲皮素的治疗潜力。研究发现少突胶质细胞在胶质瘤进展中可能发挥关键作用，而CHEK1、DLGAP5、MKI67和TOP2A在增殖性癌细胞中的特异性高表达，为靶向治疗提供了新方向。这些基因参与细胞周期调控和DNA损伤应答，其异常表达与胶质瘤的增殖活性和治疗抵抗密切相关。

值得注意的是，p53信号通路的显著富集提示该通路在胶质瘤发生发展中的核心地位。TP53突变存在于约30-40%的胶质母细胞瘤中，导致DNA损伤应答失效和凋亡逃逸。本研究鉴定的核心基因中，CHEK1作为DNA损伤检查点激酶，通过磷酸化稳定p53；TOP2A则在DNA复制和染色体分离中起关键作用，受p53调控。这些基因的过表达可能反映了p53轴功能失常，使肿瘤细胞能够绕过细胞周期检查点，加速突变积累。

槲皮素作为多酚类天然化合物，其与多个核心靶点的强结合能力及体外抗肿瘤活性，为胶质瘤治疗提供了新思路。特别是在替莫唑胺(TMZ)耐药背景下，靶向CHEK1、TOP2A等基因可能增强化疗敏感性。然而，槲皮素的低生物利用度和血脑屏障穿透性限制了其临床应用，未来需通过纳米载体递送系统或结构修饰策略优化其药物特性。

该研究存在的局限性包括缺乏体内实验验证、槲皮素靶向特异性需进一步确认等。未来研究应结合动物模型验证治疗效能，并探索核心基因作为液体活检标志物的临床价值。总之，该工作为理解胶质瘤分子机制提供了多维度视角，为开发靶向治疗策略奠定了理论基础。