嗜冷蓝细菌Argonaute蛋白实现宽温程可编程DNA切割：新型基因编辑工具的突破

本研究针对当前原核Argonaute (pAgo) 核酸酶在生理温度下活性不足、难以有效切割双链DNA的瓶颈问题，从耐冷蓝细菌中筛选出两种新型Argonaute蛋白CstAgo和CspAgo。通过系统表征发现CstAgo在10–50°C宽温度范围内均保持高活性且无5′末端偏好性，而CspAgo可在37°C下实现向导DNA介导的质粒DNA特异性切割。该研究为开发适应生理温度的新型基因编辑工具提供了关键候选分子，对推动遗传操作技术发展具有重要意义。

　　

在基因编辑技术飞速发展的今天，科学家们一直在寻找比CRISPR-Cas系统更小巧、更灵活的新型基因编辑工具。原核Argonaute蛋白（pAgo）作为一种可编程核酸酶，能够通过短链向导分子特异性识别并切割靶标核酸，且不需要PAM序列的辅助，被认为极具应用潜力。然而，大多数已发现的pAgo来源于嗜热菌，它们在生理温度下活性较低，特别是在处理双链DNA时效率不佳，这严重限制了其在真核生物基因编辑中的应用。

为了突破这一温度限制，研究人员将目光投向了耐冷微生物。俄罗斯科学院基因生物学研究所的Yuliya S. Zaitseva、Ekaterina V. Kropocheva、Andrey V. Kulbachinskiy和Daria M. Gelfenbein团队从两种嗜冷蓝细菌——斯坦尼蓝细菌（Cyanobacterium stanieri）和Calothrix sp. PCC 7103中分离出两种Argonaute蛋白：CstAgo和CspAgo。他们的研究成果发表在《Biochemistry (Moscow)》2025年第9期，系统阐明了这两种酶在宽温度范围内的催化特性及DNA切割机制，为开发低温高效基因编辑工具提供了新思路。

研究人员通过基因合成与密码子优化，在大肠杆菌中表达并纯化了CstAgo和CspAgo蛋白。关键实验技术包括：蛋白纯化（镍柱与肝素亲和层析）、体外切割活性检测（使用SYBR Gold染色及放射性标记分析）、温度与金属离子依赖性实验、质粒DNA切割实验以及向导DNA特异性测试。

研究结果主要包括以下几个方面：

一、Cyanobacterial Argonautes CspAgo and CstAgo

通过系统发育分析确认CspAgo与CstAgo属于长A类Argonaute，具备完整的催化活性中心。利用AlphaFold构建了CstAgo的三维结构模型，显示其包含典型的N、L1、PAZ、L2、MID和PIWI结构域。经两步纯化后获得高纯度蛋白，可用于后续生化分析。

二、Specificity of CstAgo and CspAgo toward guides and targets

研究表明，这两种蛋白均使用DNA向导（guide）切割DNA靶标，而对RNA向导或RNA靶标几乎无活性。切割位点位于向导序列第10与第11碱基之间。此外，CstAgo对向导5′末端核苷酸无偏好性，而CspAgo对5′末端为C的向导活性稍弱。

三、Effect of reaction conditions on the activity of CstAgo and CspAgo

CstAgo在Mg²⁺或Mn²⁺存在下均表现出高活性，而CspAgo更偏好Mn²⁺。温度梯度实验显示，CstAgo在10–50°C范围内均保持活性，是目前已知最耐冷的pAgo之一；CspAgo在20°C以上才有明显活性，最佳温度为50°C。动力学分析表明，CstAgo的切割速率比CspAgo快约10倍。

四、Cleavage of plasmid DNA by Argonautes

在质粒切割实验中，CspAgo在37°C和50°C下均可通过成对向导介导双链DNA切割，产生预期大小的线性DNA片段；而CstAgo尽管在单链DNA切割中表现优异，却无法有效切割质粒DNA。

研究结论与讨论部分指出，CstAgo和CspAgo作为新型耐冷Argonaute核酸酶，在宽温度范围内表现出高活性和良好的向导兼容性。CstAgo的低温高活性特性使其成为在低温环境中进行DNA操作的理想工具；而CspAgo虽在低温下活性较低，但能在生理温度下实现双链DNA切割，具备用于真核系统基因编辑的潜力。该研究不仅拓展了人们对pAgo功能多样性的认知，也为开发下一代基因编辑技术提供了关键实验依据。未来研究可进一步通过人工智能辅助设计、优化蛋白性能，或探索与辅助因子（如解旋酶）的协同作用，以提升其在实际应用中的效率与特异性。