3D打印培养容器中散射光测量角度的优化及其在微生物在线监测中的应用

本刊推荐：为解决传统生物量监测方法（如OD600）存在的取样污染风险及动态液体干扰问题，研究人员开发了一种3D打印光学适配器，用于优化散射光测量角度。研究发现110°测量角可显著提升信号强度及灵敏度，并经大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和酿酒酵母（S. cerevisiae）验证。该技术为生物反应器在线监测提供了创新解决方案，对提升生物工艺可控性具有重要意义。

　　

在生物技术领域中，摇瓶培养是微生物（如细菌、真菌、酵母）以及动植物细胞培养的常用方法，其简单易行、可并行处理多个实验的特点，使其在菌株开发、野生型菌株筛选和培养基优化等应用中不可或缺。然而，要实现培养条件的优化和实验的可重复性，实时监测培养过程中的关键参数——如溶解氧（DO）、二氧化碳和生物量浓度——显得尤为重要。其中，生物量的监测能够提供细胞生长动态信息，对于诱导蛋白表达等关键操作具有重要指导意义。

传统生物量监测方法，如干重测量、平板菌落计数（CFU）以及光学密度（OD₆₀₀）测量，虽然广泛应用，但存在明显局限性：它们需要取样操作，不仅耗时，还增加了污染风险，且样本准备过程繁琐，容易引入人为误差。为克服这些缺点，多种在线监测技术被开发出来，包括红外光谱、荧光法以及非侵入式的散射光测量。与基于透射法的浊度测量（受Lambert-Beer定律限制，线性范围较窄）相比，散射光测量在高光学密度区域（OD₆₀₀ > 0.5）表现出更好的性能。

然而，在线散射光测量在摇瓶系统中面临一个重大挑战：液体的动态行为。由于轨道摇动时液体形成旋转流体镰刀状分布，以及气液界面和容器顶部的反射，会干扰光学信号的稳定性。虽然已有商用设备（如CGQ和SFR vario）通过加速度传感器或多周期采样策略来缓解该问题，但反射干扰仍未彻底解决。在先前的研究中，团队开发了一种集成棱镜偏转光路的3D打印培养容器，实现了横向散射光测量，有效减少了干扰。本研究在此基础上，进一步优化信号质量，重点探究最佳激发与检测角度，以提升系统灵敏度和可靠性。

为开展研究，团队采用3D打印技术制备光学适配器，其核心是一个可安装于SFR vario平台的环形底座，内置六个测量角度（110°至160°）的波导通道。适配器中心为容积14 mL的反应容器，每个角度对应一对激发和检测波导，波导末端粘附玻璃片以增强透光性，并采用不锈钢片隔离通道间串扰。此外，设计上盖防止液体溅出，外加遮光罩排除环境光干扰。研究还通过光学平台实验评估了波导长度（30 mm至45 mm）对传输信号的影响，证实信号强度随长度增加而衰减（损耗约0.84 dB/cm）。同时，制备不同底座厚度的适配器（薄、中、厚），以区分波导长度和测量角度对信号的独立效应。

微生物培养部分选用大肠杆菌Escherichia coli BL21 DE3、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DSM 23778和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae NCYC 1024作为模型生物，在LB或YPD培养基中预培养后，收获静止期细胞，经PBS洗涤并重悬，制备OD₆₀₀ 0–20的梯度稀释样本。离线OD₆₀₀采用光光度法测定，在线散射光测量则在SFR vario平台上进行，以630 nm LED为光源，在80 rpm摇动下采集90秒数据。

研究结果显示，波导长度显著影响信号强度。45 mm长波导比30 mm波导信号降低15.8%，且适配器底座厚度增加（导致波导变长）使信号强度下降6.9%–17.4%，线性拟合斜率降低12.6%–20.7%。这表明缩短波导长度有助于提升信噪比（SNR）。

测量角度的影响更为显著。角度增加10°、20°和30°分别导致信号强度降低15.1%、31.2%和43.4%，且较小角度（如110°）对应更高的拟合斜率（灵敏度提升38.9%相比140°）。通过适配器内部设计，团队实现了角度与波导长度的解耦分析，确认110°为最优角度。

在微生物验证实验中，110°角度对所有测试生物（E. coli、B. subtilis、S. cerevisiae）均表现出最高信号强度和灵敏度。在OD₆₀₀ < 5区域，信号与OD呈指数关系；OD₆₀₀ > 5时则呈线性，且110°角度线性拟合决定系数（R2）高，斜率最大。相对标准偏差（RSD_b）计算显示，B. subtilis和S. cerevisiae在110°角度下RSD_b < 5%，表明测量精密度良好。

综上所述，本研究通过3D打印光学适配器系统评估了散射光测量角度与波导长度的优化组合，明确110°为最佳角度，可显著提升生物量在线监测的信号强度和灵敏度。该结论适用于多种工业相关微生物，为设计高性能培养容器提供了关键参数。由于3D打印技术的灵活性，该适配器可进一步适配不同尺寸或几何形状的培养容器，推动生物过程分析技术（PAT）的定制化发展。研究成果发表于《Analytical and Bioanalytical Chemistry》，为微生物培养的在线监测提供了创新方法学支撑，具有重要的应用前景。