整合scFv筛选与CAR-T细胞生成：靶向CLL1的急性髓系白血病免疫治疗新策略

本文开发了一种基于高通量PacBio测序的scFv噬菌体展示文库（4.5×107独特全长scFv），成功筛选出靶向C型凝集素样分子1（CLL1）的单链抗体，并构建第三代CAR-T细胞（含CD28/4-1BB/CD3ζ共刺激域）。体外和体内实验证明其能特异性清除CLL1+AML细胞，为急性髓系白血病（AML）的个体化免疫治疗提供快速一体化平台。

　　

Abstract

癌症免疫治疗领域迎来重大突破，其中嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的发展尤为显著。本研究基于新开发的scFv噬菌体质粒文库，将单链可变片段（scFv）开发与CAR T细胞生成相结合。高通量长读长PacBio测序在生成的文库中识别出4.5×10⁷种独特全长scFv蛋白。作为原理验证，我们筛选了靶向C型凝集素样分子1（CLL1）的scFv，并将其克隆到第三代逆转录病毒CAR骨架中。功能实验揭示了这些CAR T细胞在体外靶向CLL1阳性AML细胞的特异性和效力。体内研究显示，与对照组相比，实验组肿瘤负荷降低且生存率提高。综上，针对CLL1的肿瘤特异性scFv筛选可快速生成具有有效体内肿瘤杀伤作用的AML特异性CAR T细胞。

What's New?

急性髓系白血病（AML）是一种快速进展的血液癌症。推进嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，特别是通过将单链可变片段（scFv）发现快速转化为CAR构建体，可能会改善临床结果，尤其是促进患者个体化CAR T细胞的开发。本研究利用治愈的AML患者样本生成了一个scFv文库，包含超过4500万个独特scFv。作者引入了一种将scFv识别与CAR T细胞生成相结合的整合方法。体外和体内功能实验证明了这些CAR T细胞针对AML靶点的特异性和效力。该方法证明了一个快速、一站式的scFv发现和CAR T细胞生成平台是可行且有效的，代表了AML免疫治疗的重大进展。

1 INTRODUCTION

抗体和抗体片段介导的靶向免疫治疗正在通过提供精确且有效的传统化疗替代方案来改变癌症治疗。单链可变片段（scFv）是通过短肽接头连接抗体重链（VH）和轻链（VL）可变区而设计的，保留了原始抗体的抗原结合特异性，并在癌症治疗中具有多种应用，包括单克隆抗体开发、靶向药物递送和CAR T细胞疗法。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准七种包含scFv的CAR T细胞疗法用于治疗血液恶性肿瘤，但不包括髓系白血病。CAR T细胞的成功取决于scFv的特异性和亲和力，这使得开发稳健的scFv文库变得至关重要。尽管已经创建了几个现有的scFv噬菌体文库，但有些文库因供体库有限、质量评估不足或缺乏支持其治疗用途的证据而面临局限性。

急性髓系白血病（AML）是一种以髓系细胞异常增殖为特征的侵袭性血液癌症，需要及时有效的治疗。传统化疗仍然是许多AML患者的标准护理，但在某些亚组中，如老年人或复发或难治性疾病患者，其存在显著毒性和有限疗效。近年来，靶向治疗已成为应对AML所带来挑战的一种有前景的方法。AML治疗干预的靶点包括CD33、CD123、CD70和CLL1等抗原。C型凝集素样分子1（CLL1），也称为CLEC12A，已成为一个有吸引力的靶点，因为CLL1通常在健康造血干细胞或其他组织上不表达或表达极低，但在髓系白血病细胞（包括白血病干细胞）上高表达。因此，靶向CLL1可能为治疗AML提供一种特异性和选择性的方法。

在本研究中，我们通过将scFv基因的全部 repertoire 引入噬菌体基因组中生成了一个scFv文库。使用第三代PacBio测序技术，以其生成高保真长读长（>10 kbp）并允许检索全长scFv（约800 bp）的能力，我们彻底检查了文库的覆盖度和多样性。筛选工作获得了对CLL1具有特异性的独特scFv。这些scFv随后被用于设计CAR T细胞，在体外和体内对CLL1阳性肿瘤细胞表现出强大的细胞毒性。抗CLL1 scFv在CAR T细胞中经过验证的功能性扩展了其在各种治疗和生物技术领域的潜在应用。此外，所开发的scFv文库作为一个多功能且可扩展的资源，为揭示多种癌症类型的额外靶点提供了丰富的基础。

2 MATERIALS AND METHODS

2.1 Isolation of PBMCs

从30名健康供者采集的外周血样本来自德国海德堡红十字会血库。从21名接受过供体淋巴细胞输注（DLI）的AML患者采集的外周血样本来自海德堡大学医院。使用Ficoll密度梯度离心在SepMate-50管中分离外周血单核细胞（PBMCs）。按照制造商说明使用RNeasy Mini Kit（Qiagen, Netherlands）进行RNA提取。

2.2 Synthesis of cDNA

简而言之，使用500 ng分离的RNA模板，通过随机六聚体引物和SuperScript IV逆转录酶（ThermoFischer, USA）按照用户手册合成第一链cDNA。

2.3 PCR amplification of antibody variable regions

使用一组引物（表S1）扩增抗体的可变区。每个基因使用单独的正向和反向引物。对于每个PCR反应，制备2管50 μL反应混合物，每管含有2.5 μL cDNA。扩增程序包括98°C初始变性3分钟，随后进行25至28个循环的98°C 30秒、48°C至63°C退火30秒和72°C延伸30秒。最后在72°C进行3分钟最终延伸。

2.4 Construction of scFv phagemid library

将2 μg扩增的VH PCR产物分别用NcoI（NEB, USA）和HindIII（NEB, USA）进行双酶切，而VL PCR产物用MluI（NEB, USA）和NotI（NEB, USA）消化，均按照制造商用户手册进行。消化后的PCR样品通过琼脂糖凝胶使用Gel DNA recovery kit（Zymo Research, Germany）进行纯化。纯化的VH PCR产物以4:1摩尔比在T4 DNA连接酶（Thermo Scientific, USA）存在下与经NcoI和HindIII线性化的pSEX81（Progen, Heidelberg）连接。连接产物通过异丙醇沉淀浓缩，并分别使用MicroPulser电穿孔仪（Bio-Rad, CA）的Ec1程序（1.8 kV, 1脉冲）转化到25 μL电感受态大肠杆菌（E. coli）TG1细胞（BioCat, Germany）中。通过进行转化细胞的系列稀释并计数克隆数来量化文库大小。随后，使用GeneJET plasmid Maxiprep kit（Thermo Scientific, USA）提取噬菌粒。将含有VH的pSEX81载体用MluI和NotI消化并进行凝胶纯化，以便与MluI/NotI双消化的VL PCR产物连接。

2.5 PacBio sequencing and bioinformatics analysis

使用NcoI和NotI从构建的噬菌粒中切下scFv片段，并通过琼脂糖电泳纯化。使用Qubit（Thermo Scientific, USA）和Bioanalyzer 2100（Agilent, USA）测量纯化scFv的数量和质量。随后在PacBio sequel II平台（Novogene, China）上对scFv DNA片段进行测序。测序覆盖度和质量统计总结在表S2–S4中。从PacBio测序获得的高保真读段被转换为FASTA文件并提交给IMGT的HighV-QUEST。通过选择“智人”、“IG”受体类型和“单链可变片段分析”进行分析。选择“框内V(D)J”序列，并进一步过滤，要求测序数据的V区与IMGT数据库中最接近的种系基因和等位基因的V区之间具有>85%的一致性。

2.6 scFv-phage library production

简而言之，将带有scFv文库的大肠杆菌转化子的25 mL过夜培养物在补充有100 μg/mL氨苄青霉素和100 mM葡萄糖的2xYT培养基中培养。培养物在37°C、250 rpm摇荡下维持至600 nm光密度（OD₆₀₀）达到0.5（计为1.25×10¹⁰个细胞）。然后，将2.5×10¹¹个空斑形成单位（pfu）的M13K07?pIII超噬菌体（MOI=20）引入细菌培养物中。随后将混合物在37°C无摇荡下孵育30分钟，接着在200 rpm摇荡下再孵育30分钟。通过离心沉淀细胞，并重悬于400 mL补充有100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的2xYT培养基中。悬浮液在25°C、250 rpm摇荡下培养过夜。收获培养上清液，并加入100 mL冰预冷的50%（w/v）PEG 6000和10 mL 4 M NaCl。将混合物在冰上温和摇荡孵育2小时。通过4°C下10,000 g离心2小时收集噬菌体颗粒，并重悬于1 mL含有10%甘油的PBS中。使用空斑计数测定法测定噬菌体-scFv的感染滴度。将10 mL大肠杆菌XL1-Blue MRF'细胞在2xYT培养基中37°C培养至OD₆₀₀达到0.5，并暴露于噬菌体的系列稀释液中，37°C孵育30分钟。将100 μL样品铺在含有50 μg/mL卡那霉素的2xYT琼脂平板上，37°C孵育过夜。计数形成的空斑以计算噬菌体滴度。

2.7 Panning of phage display scFv library

对于第一轮筛选，将每孔3 μg CLL1抗原（AcroBiosystems, USA）溶于100 μL PBS中，包被在Immuno 96 MicroWell Plates（Nunc, Denmark）上，4°C过夜。在第二轮和第三轮筛选中，分别使用1 μg和0.3 μg CLL1。包被后，用含有0.05%（v/v）Tween 20的PBS（PBST）中的5%（w/v）脱脂奶粉封闭含抗原的孔。然后将含有约6×10¹¹个噬菌体颗粒的50 μL噬菌体文库添加到每个孔中，随后在室温下孵育2小时。通过用PBST洗涤板15次，再用PBS额外洗涤15次，去除未结合的噬菌体。通过用150 μL 10 μg/mL胰蛋白酶在37°C孵育30分钟来洗脱结合的噬菌体。将150 μL指数生长期的大肠杆菌TG1细胞（OD₆₀₀为0.4–0.5）添加到洗脱的噬菌体中，37°C无摇荡孵育30分钟，然后在37°C、650 rpm摇荡下在块式加热器（Thermo Scientific, USA）中再孵育30分钟。然后将20 μL感染的细胞铺在补充有氨苄青霉素（100 mg/mL）和葡萄糖（1% w/v）的2xYT琼脂平板上，37°C孵育过夜。为生成用于下一轮筛选的所选scFv噬菌体，将720 μL含有100 μg/mL氨苄青霉素和100 mM葡萄糖的2xYT培养基加入到剩余的280 μL感染细胞中，并在37°C摇荡培养至OD₆₀₀达到0.4–0.5。用1×10¹⁰个M13K07辅助噬菌体颗粒（Thermo Scientific, USA）在37°C无摇荡下感染细菌细胞，随后在37°C、650 rpm下孵育30分钟。离心MTP板（3220 g，20分钟）。更换培养基为1 mL含有氨苄青霉素和卡那霉素的2xYT，并在30°C、850 rpm下孵育过夜以生产新的抗体噬菌体。含有噬菌体的上清液可直接用于下一轮筛选。挑取琼脂平板上的单个克隆，并对噬菌粒DNA进行Sanger测序。

2.8 Cloning of anti-CLL1 CAR

通过PCR扩增从筛选中鉴定出的抗CLL1 scFv的编码序列。将纯化的PCR产物分别插入到经NcoI/BamHI双酶切的逆转录病毒载体RV-SFG.CD28.4–1BB.CD3 ζ（由美国休斯顿贝勒医学院细胞与基因治疗中心的Malcolm Brenner教授惠赠）中，使用In-Fusion克隆（Takara Bio, Shiga, Japan）按照制造商说明进行。将1 μL重组子转化到NEBstable感受态细胞（NEB, USA）中。将细菌细胞涂布在琼脂平板上，挑取单个克隆，并通过Sanger测序确认scFv的插入。

2.9 Generation of anti-CLL1 CAR-T cells

在HEK293T细胞中通过共转染3.75 μg包装质粒PegPam3、2.5 μg包膜质粒RDF（均由Malcolm Brenner教授提供）和3.75 μg转移质粒RV-SFG.CLL1.CD28.4–1BB.CD3ζ来生产抗CLL1.CD28.4–1BB.CD3ζ逆转录病毒。 thawed冻存的PBMCs，将1×10⁶个细胞接种到包被有抗CD3/抗CD28抗体的24孔板的每个孔中。24小时后，用白细胞介素-7（IL-7）和白细胞介素-15（IL-15）刺激细胞。第三天，将0.2×10⁶个活化的T细胞添加到24孔板的每个孔中，这些孔包被有在48小时和72小时收集的1 mL逆转录病毒CLL1.CD28.4–1BB.CD3ζ。在转导后的第四天，通过使用抗人山羊F(ab) IgG (H + L) PE抗体（Dianova, Hamburg, Germany）的流式细胞术评估转导效率。用于功能测定的效应细胞数量根据确定的转导效率进行调整。CAR T细胞在含有45% RPMI-1640和45% EHAA培养基（Clicks）、补充有2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）、10 ng/mL IL-7和5 ng/mL IL-15的培养基中培养。

2.10 Cell lines

细胞系MV4-11（RRID: CVCL_0064）、HL60（RRID: CVCL_0002）和HEK 293 T（RRID: CVCL_0063）购自美国模式培养物集存库（ATCC）。K562（RRID: CVCL_0004）细胞购自德国微生物和细胞培养物保藏中心（Braunschweig, Germany）。ZsGreen-MV4-11通过将ZsGreen基因慢病毒转导到野生型MV4-11细胞中获得。所有白血病细胞系在含有10%胎牛血清（10% FBS）和1%青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中，在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。HEK 293 T细胞在含有10% FBS的IMDM培养基中培养。所有细胞系在过去3年内均通过SNP分析进行了认证，且无支原体污染。

2.11 Surface protein analysis

通过使用抗CLL1-APC（克隆50C1）、抗CD33-APC（克隆p67.7）和抗CD3-BV510（克隆OKT3）的流式细胞术分别定量肿瘤细胞表面的CLL1和CD33表达以及T细胞上的CD3表达。所有抗体均购自BioLegend, Netherlands。为确保染色程序的准确性，使用7AAD染料（BD Biosciences, USA）有效排除死细胞。

2.12 Intracellular cytokine staining

为评估细胞因子释放，将CAR T细胞与靶肿瘤细胞HL60、MV4-11、MV4-11 zsGreen以1:2的比例在96孔板（Sarstedt, Germany）中共培养5小时，存在5 μg/mL布雷菲德菌素A（Biolegend, CatNo: 42060, Netherland）和2.0 μM莫能菌素（Biolegend, CatNo: 420701, Netherland）的情况下进行5小时。然后使用FoxP3缓冲液组（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）固定和透化细胞。使用抗IFNγ-Alexa Fluor 488（克隆4S.B3, Biolegend, Netherland）和抗TNFα-BV421抗体（克隆Mab11, Biolegend, San Diego, USA）染色细胞内干扰素γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子α（TNFα）。所有实验样品使用LSRII或Symphony A3细胞分析仪（BD Biosciences, USA）进行分析，并使用FlowJo软件处理和解释所得数据。

2.13 Short-term and long-term coculture assay

将2×10⁴个抗CLL1 CAR T细胞与4×10⁴个HL60、MV4-11、MV4-11 zsGreen或K562细胞在含有200 μL（短期）或800 μL（长期）CAR T细胞培养基（见上文）的48孔平底板中共培养。在短期测定中，2天后通过流式细胞术（FC）分析细胞。使用APC-抗CD33抗体（Biolegend, 克隆p67.7）染色肿瘤细胞，并使用FITC-抗CD3抗体（Biolegend, 克隆OKT3）染色T细胞。在长期测定中，每隔一天向共培养物中加入额外的4×10⁴个肿瘤细胞以再次攻击CAR-T细胞。

2.14 Mouse experiments

六至十周大的NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠购自海德堡德国癌症研究中心（DKFZ），并饲养在跨学科生物医学设施（IBF）中。经过10天的适应期后，每只小鼠通过尾静脉注射1×10⁶个肿瘤细胞以建立AML异种移植模型。在实验组中，起始后5天，每只小鼠通过尾静脉注射接受5×10⁶个CAR T细胞。使用Xenogen体内成像系统（IVIS; Caliper Life Sciences, USA）通过生物发光成像（BLI）评估肿瘤负荷和 trafficking。所有实验程序均按照IBF海德堡概述的指南进行。

2.15 Statistical analysis

使用GraphPad Prism 9软件（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）进行统计分析。使用未配对参数t检验计算p值。

3 RESULTS

3.1 scFv phagemid library generation

从30名健康供者和21名接受供体淋巴细胞输注（DLI）后完全缓解的AML患者中PCR扩增VH和VL基因（图1A）。最初，使用基于重组的In-Fusion克隆将这些基因插入噬菌粒载体pSEX81中，但当多个VH和VL片段同时引入反应时，重叠PCR未能生成VH-(G4S)₃-VL片段（图S1A）。因此，改用传统的限制性酶切和连接克隆（图S1B）。单独的、无偏见的PCR反应，每个反应使用独特的正向引物和相应的反向引物，在琼脂糖凝胶上产生预期的约400 bp条带（图S2A,B）。将24个用NcoI/HindIII消化的VH片段连接到pSEX81载体中，并转化到TG1细菌细胞中。每次转化获得约0.51×10⁶个菌落，总计约12×10⁶个菌落。然后，用MluI/NotI消化携带VH repertoire的pSEX81载体以插入VL基因。总共进行了264次转化，获得约1.35×10⁸个菌落（图1A, 图S1）。

3.2 High-throughput sequencing and analysis of scFv phagemid library

为确保用于测序的scFv真正代表噬菌粒文库，直接从噬菌粒中切下scFv片段，产生约800 bp DNA（图S3A,B）。从一个PacBio Sequel II SMRT cell中，生成约2.7×10⁸个subreads，产生约1.5×10⁶个环状共识序列（CCS）读段（图S3C和表S2和S3）。进一步过滤CCS读段以消除双加载孔或任何低准确度的读段。过滤后，获得693,364个具有高准确度的长读段，称为HiFi读段（图1B, 表S4）。这些HiFi读段的质量值（QV）等于或大于20（QV ≥20），代表99%或更高的准确度。HiFi读段的平均长度为805 bp。

使用IMGT的HighV-QUEST将这些HiFi读段映射到人类种系IgG基因片段，识别出约1.2×10⁶个可变域（即每个scFv包含两个V区）（图1C）。值得注意的是，1,068,017（86.3%）个V区与IMGT数据库中最接近抗体的V基因显示出>85%的一致性（这是抗体repertoire的标准过滤阈值），并被定义为“确信”序列。其中99%代表包含重链和轻链V域的scFv克隆（528,745个）（图1C）。

重新评估包含约1.35×10⁸个菌落的噬菌粒文库，基于PacBio测序统计，识别出约1.03×10⁸个scFv，几乎覆盖了所有人类种系IgG亚家族（图1D）。详细分析（不考虑等位基因）显示，重链有56个可变基因（HV）、25个多样性基因（HD）和6个连接基因（HJ）；Kappa轻链有26个可变基因（KV）和5个连接基因（KJ）；lambda轻链有38个可变基因（LV）和6个连接基因（LJ）（图S4）。所有识别的基因片段均具有功能。重链中可变、多样性和连接基因与轻链中可变基因的关联和频率各不相同。主要的基因关联包括IGHV1和IGKV1（41.3%）、IGHV1和IGLV3（17.4%）；IGHD3和IGKV1（34.7%）、IGHD3和IGLV3（14.7%）；IGHJ4和IGKV1（22.0%）、IGHJ5和IGKV1（21.2%）、IGHJ4和IGKV3（9.3%）、IGHJ5和IGKV3（9.2%）（图1E）。

3.3 Amino acid distribution of scFvs

使用Biostrings将DNA信息翻译成氨基酸（AA）。总共获得544,535个翻译产物，其中403,803个（74.2%）长度为220至290 AA，表明是全长的scFv蛋白。值得注意的是，85.6%（345,643）落在260至285 AA范围内（图1F,G）。最主要的长度是274 AA，占总数的2.3%（图1G）。在403,803个全长scFv中，231,997个（57.5%）是独特的。观察到的最频繁的scFv出现了2881次（0.7%），而最不频繁的scFv，总计208,961个，占整个文库的51.7%（图1H）。重新计算噬菌粒文库中的AA多样性，估计有约1.35×10⁸个菌落，表明有约1.0×10⁸个长度为220至300 AA的scFv蛋白，其中约4.5×10⁷个是独特的（图1I）。

3.4 Discovery of anti-CLL1 scFvs

作为原理验证，我们鉴定了靶向CLL1的scFv。在TG1细菌细胞中包装表达scFv的噬菌体文库，通过Western blot凝胶上的95 kD scFv-pIII融合蛋白确认（图2A）。然后针对纯化的CLL1筛选scFv文库。选择CLL1抗原是因为其在>90%的恶性细胞上高表达，而在健康干细胞上表达较低（图2B）。我们进行了三个独立的筛选实验，每个实验包括三轮选择。在每个筛选实验的第三轮选择后，随机选择35、25和36个菌落进行Sanger测序，分别鉴定出12、17、12个功能全长scFv，其中每个筛选分别有3、3、5个是独特的（图2C, 表S5）。总共鉴定出六个独特的scFv序列并用于进一步分析（图2C）。

氨基酸保守性分析显示序列一致性范围从43.1%（在No. 4和No. 6之间）到75.5%（在No. 5和No. 6之间）（图2D）。为探索序列模式，使用ggseqlogo生成了这六个独特scFv序列的序列标识。正如预期，互补决定区（CDR）显示出最高的变异性，而框架区（FR）支架则更为保守（图2E）。此外，重链和轻链之间的接头肽KLEEGEFSEA保持不变，进一步支持了序列的可靠性（图2E）。

3.5 CLL1-CAR T cell generation and characterization

将每个鉴定出的scFv分别插入到第三代CAR载体中，该载体包含人IgG1 CH2CH3衍生的铰链、CD28和4-1BB的刺激域以及CD3ζ信号域的表达盒（图3A）。通过逆转录病毒转导生成抗CLL1-CAR T细胞。用scFv编号1、2和4转导的T细胞中的CAR表达水平分别达到24.2%（范围：20.5%–37.9%）、36.8%（范围：30.7%–41.2%）和12.6%（范围：8.9%–15.5%），而编号3未显示CAR表达。携带构建体5和6的T细胞显示出更高的CAR表达水平，分别为48.9%（范围：39.8%–51.6%）和65.1%（范围：54.3%–68.3%）（图3B）。在随后的测定中，根据CAR阳性细胞的百分比调整T细胞数量。

为评估生成的CAR T细胞的功能性和特异性，首先评估了各种白血病细胞系中的CLL1表达。K562细胞未显示