伊利湖流域500公里水生连续体中蓝藻有害藻华相关的微生物功能与类群时空解析及其生态意义

本文推荐一项关于伊利湖流域微生物组功能与蓝藻水华（cHABs）关联性的重要研究。作者通过qPCR和高通量测序揭示，上游水体中磷获取、反硝化和固氮基因（如phoD, nirK, nifH）丰度较高，而下游伊利湖中微囊藻毒素合成基因（mcyE）表达增强。研究强调环境梯度通过改变微生物群落结构间接影响功能表达，网络分析进一步表明功能基因表达与生物因子的关联强于基因存在，凸显微生物互作在cHABs形成中的关键作用。

　　

1 Introduction

伊利湖西部自20世纪中后期因农业流域营养盐（氮、磷）输入呈现富营养化。尽管通过《大湖水质协议》（GLWQA）实施最佳管理实践（BMP）以降低磷负荷，该湖仍频发以产毒蓝藻（如微囊藻Microcystis）为主的有害藻华（cHABs）。以往研究多关注水文和营养盐负荷的作用，而生物互作在cHABs中的作用常被忽视。水生微生物组通过溶解无机磷、矿化有机磷及参与氮固定（固氮）、硝化、反硝化等过程驱动营养循环，某些类群还能降解蓝藻毒素（如微囊藻毒素）。蓝藻聚集体周围的微生物（称为“互作组”interactome）可为蓝藻直接提供营养，而自由生活的微生物则通过再生氮供应和回收有机质间接支持cHABs。这些微生物对环境变化敏感，是生态系统响应干扰的重要指标。本研究沿泰晤士河–圣克莱尔湖–底特律河–伊利湖西部500公里连续体，跨季节探究微生物功能基因（存在与表达）和群落组成的变化，以揭示微生物过程与cHABs的关联。

2 Methods

2.1 Study Sites and Sampling

2019年5月至10月每月采样，涵盖泰晤士河上游4站、圣克莱尔湖3站、底特律河1站和伊利湖西部4站（2021年9月增加5站）。测定水温（Temp）、电导率（Cond）、pH，并采集水样分析总磷（TP）、总溶解磷（TDP）、可溶性活性磷（SRP）、总氮（TN）、总溶解氮（TDN）、铵（NH₄⁺）和硝态氮/亚硝态氮（NO_x）。

2.2 DNA Processing and Metabarcoding

过滤水样提取DNA和RNA，针对16S rRNA基因V4–V5区扩增测序（引物515F/926R）。RNA经反转录为cDNA。测序在Illumina MiSeq平台完成。

2.3 Bioinformatic Analysis

使用Dada2流程处理序列，去除嵌合体，以Silva数据库（v128）和BOLD数据库（蓝藻）分类ASVs。过滤古菌、叶绿体和真核生物序列，稀释抽平至10,000 reads/样本。

2.4 qPCR

通过qPCR和RT-qPCR定量营养循环和微囊藻毒素生产相关基因的DNA和cRNA丰度。靶点包括氮循环相关基因：细菌和古菌氨单加氧酶（B-amoA, A-amoA）、亚硝酸盐氧化还原酶（nxrA）、异化亚硝酸盐还原酶（nrfA）、硝酸盐还原酶（narG）、细菌和古菌亚硝酸盐还原酶（B-nirK, A-nirK）、一氧化二氮还原酶（nosZ, nosZII）和固氮酶（nifH）；磷循环相关基因：碱性磷酸酶（phoD）、酸性磷酸酶（phoC）、膦酸乙醛水解酶（phnX）和吡咯喹啉醌（pqqC）；以及微囊藻毒素合成基因（mcyE）。反应效率81%–110%。

2.5 Microcystin Cyanotoxin Extraction and Analysis

GF/C过滤器收集颗粒态微囊藻毒素，ELISA法检测。

2.6 Statistical Analysis

利用ggplot2可视化群落和功能基因数据，计算Spearman相关性（经BH校正），Bray–Curtis相异度评估群落变化，Mantel检验分析环境与功能/群落关联。通过sparCC构建共现网络（保留|ρ|>0.25且p<0.05的强相关），Gephi可视化。

3 Results

3.1 Physico-Chemical Parameters

pH范围8.01–9.02，水温最高27.1°C（7月圣克莱尔湖）。泰晤士河营养盐浓度最高（TP达179 μgL^?1），沿程至伊利湖递减。圣克莱尔湖平均TP 15.1–24.3 μgL^?1（中营养），伊利湖TP 32.2–46.3 μgL^?1（富营养）。TN:TP和TDN:TDP质量比从上至下降低。

3.2 Microbial Community Composition

伪单胞菌门（Pseudomonadota）和拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度上游高，放线菌门（Actinomycetota）和蓝藻门（Cyanobacteriota）下游增加。蓝藻在5–6月占比低（0.5%–0.7%），8月伊利湖升至22.8%。春夏季蓝藻群落以Planktothrix、Synechococcus和Aphanothece为主；Synechococcus在圣克莱尔湖持续优势（9月占微生物群落9.5%）；Microcystis 8–10月增多（8月伊利湖占5.4%）；泰晤士河9–10月以Planktothrix为主。

3.3 Link Between Microbial Functions and Environmental Variables

磷获取、反硝化和固氮基因及转录本上游丰度高，微囊藻毒素基因（mcyE）下游高。基因丰度（而非表达）与环境变量相关，但功能变化与微生物群落变化关联而非直接响应环境梯度。mcyE基因拷贝数与颗粒态微囊藻毒素浓度显著相关（ρ=0.96, p<0.01），转录本无关（ρ=0.44, p=0.2）。

3.4 Influence of the Changes in Environmental Variables on Community and Functional Dissimilarities

群落组成变化与环境变量距离显著正相关（Mantel's r=0.3, p<0.01），功能变化则不显著（r=0.1, p>0.05）。功能变化与群落变化显著相关（r=0.2, p<0.05），且基因表达与群落关联更强。

3.5 Co-Occurrence Networks

基因表达网络比基因存在网络连接更紧密（边数161 vs. 138），聚类系数更高（0.58 vs. 0.52）。ASV1（Pseudomonadota–Fonsibacter）和ASV2（Actinomycetota–Nanopelagicus）在两者中均高度连接，与多种功能基因负相关。pqqC（磷溶解）表达与11个ASVs相关，反硝化基因（nosZ, nosZII, narG）表达与7个ASVs相关。蓝藻ASVs（如Microcystis ASV31）与核心ASVs及mcyE存在/表达相关。mcyE仅与一株Microcystis ASV31正相关。

4 Discussion

4.1 Functional Gene Abundance More Strongly Correlates With Environmental Variables Than Transcripts

基因存在与营养盐、毒素浓度相关性强于转录本，反映环境梯度对功能潜力的影响，而转录本短暂性导致其与环境变化解耦。磷矿化/溶解基因（phoD, phoC）与磷浓度正相关，phnX转录:基因比与磷负相关，提示磷匮乏时表达增强。古菌amoA转录本与NH₄⁺正相关，或更好指示硝化过程。反硝化基因转录本广泛检出，表明表面水体存在该过程潜力。固氮基因（nifH）与磷形态相关而非氮，高磷条件促进蓝藻（Anabaena, Planktothrix）nifH表达。mcyE基因与TN、NO_x和TN:TP比负相关，因产毒蓝藻在下游低氮环境中增多。

4.2 Changes in Microbial Functions Are Linked to Changes in Microbial Community Structure

环境变化通过改变群落结构间接影响功能而非直接作用，表明功能冗余不完全。功能-群落关联性强（尤其基因表达），强调需结合群落组成变化理解微生物过程响应。

4.3 Cyanobacteriota Co-Occur With a Gene Involved in Microcystin Toxin Production, but With Few Microbial Taxa

网络分析揭示基因表达与ASVs（如Limnohabitans, Flavobacterium）更多连接，这些类群参与N、P循环，可能为蓝藻提供营养。 streamlined基因组微生物（如Fonsibacter, Nanopelagicus）普遍存在且高度连接，符合“黑皇后假说”（依赖群落资源供给）。Microcystis ASV31（与前期研究优势ASV1相同）与mcyE密切关联，或为产毒关键类群。

5 Conclusion

微生物功能潜力沿环境梯度递减，但毒素生产基因下游增强。功能变化由群落结构变化介导，基因表达的网络关联揭示微生物互作在cHABs中的核心作用。 streamlined基因组类群与蓝藻协同互作，支持“黑皇后假说”。整合微生物过程与类群关联为预测cHABs发生与毒性提供新视角。

Author Contributions

S.C., T.E., S.B.W.和J.C.设计研究；S.C., A.Z., N.D., A.D., T.F.和R.M.M.采样；S.C., L.P.和A.Z.提供分析数据；S.C.主导撰写，所有作者参与修改。

Acknowledgements

感谢实验室和野外工作人员及评审专家。资金来自加拿大基因组研发计划（GRDI）、大湖保护计划（GLPI）、NSERC（RGPIN-2019-03943）和NIEHS/NSEF资助的Great Lakes Center for Fresh Waters and Human Health（1P01ES02328939-01, OCE-1840715）。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。