I组裂解性多糖单加氧酶（LPMO15-1）在两种森林害虫松墨天牛和星天牛蜕皮过程中几丁质表皮周转的关键作用

本研究发现，松墨天牛（Monochamus alternatus）和星天牛（Psacothea hilaris）的I组裂解性多糖单加氧酶（LPMO15-1）在蛹-成虫蜕皮过程中对旧表皮内角质层几丁质的降解至关重要。通过RNA干扰（RNAi）和透射电镜（TEM）分析证实，该酶缺失导致昆虫无法完成蜕皮并死亡，表明LPMO15-1是害虫防治的潜在靶点。

　　

INTRODUCTION

昆虫必须周期性地蜕去富含几丁质和蛋白质的旧表皮，并形成新表皮，这一过程称为蜕皮（ecdysis），是生长发育直至成虫期的关键生理过程。在每次蜕皮周期中，除了沉积新表皮外，旧表皮内未骨化部分的降解也同时发生，这对完成蜕皮至关重要。蜕皮液中的表皮降解酶，如几丁质酶（chitinolytic enzymes）和蛋白酶（proteolytic enzymes），在旧表皮周转中起主要作用。表皮几丁质降解涉及多种酶，包括裂解性多糖单加氧酶（LPMOs, EC 1.14.99.53）、内切几丁质酶（CHTs, EC 3.2.1.14）和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGs, EC 3.2.1.52），它们协同作用将几丁质分解为N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）。LPMOs氧化裂解不溶性结晶几丁质纤维，使其部分解晶或产生半溶性几丁多糖，从而易于被CHTs水解成可溶性短几丁寡糖，NAGs进一步将这些寡糖分解为GlcNAc单体。

LPMOs是单核铜酶，可氧化裂解糖苷键。它们都含有两个组氨酸残基，以组氨酸支架（Cu-histidine brace）结构配位铜原子。LPMOs最初在细菌中被鉴定为碳水化合物结合蛋白，协助糖苷水解酶水解多糖。它们可催化几丁质和纤维素等多种结晶多糖糖苷键的氧化裂解。根据碳水化合物活性酶数据库（CAZy），LPMOs被分为8个辅助活性（AA）家族：AA9-AA11和AA13-AA17。许多研究还证明了LPMOs与CHTs/NAGs以及纤维素酶（如β-葡萄糖苷酶（GH1）、纤维二糖水解酶（GH6）和内切葡聚糖酶（GH7和GH9））在高度顽固的几丁质和纤维素降解中的协同效应。

除微生物外，LPMOs在包括昆虫和植物在内的动物中也有发现。昆虫LPMOs于2018年首次报道，被确定为属于AA15家族（LPMO15）。系统发育分析表明，昆虫LPMO15s可进一步分为至少四个亚组：I组（LPMO15-1）、II组（LPMO15-2）、III组（LPMO15-3）和IV组（鳞翅目特异性LPMO15）。微生物来源LPMOs的生物学功能已被广泛研究，例如，作为毒力因子降解宿主植物细胞壁和宿主昆虫中肠围食膜（PM）。相比之下，尽管转录组学和蛋白质组学以及果蝇（Drosophila melanogaster）和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的全基因组RNAi研究表明昆虫LPMO15s参与表皮、气管和PM相关几丁质的降解，但其确切生理功能尚未得到很好研究。目前仅对赤拟谷盗和飞蝗（Locusta migratoria）进行了功能研究，证明了I组LPMO15-1和III组LPMO15-3分别在蜕皮过程中几丁质表皮和PM周转中的生理作用。

松墨天牛（Monochamus alternatus）钻入并取食松树，是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的主要载体。该线虫是松树萎蔫病的病原体，可迅速杀死松树，对森林生态系统造成严重破坏和经济损失。星天牛（Psacothea hilaris）也是一种破坏性蛀干害虫，危害桑树和无花果树。本研究报道了松墨天牛和星天牛中I组LPMO15-1基因（MaLPMO15-1和PhLPMO15-1）的表征和生理功能研究。通过实时定量PCR（qPCR）分析了这两个基因在发育后期的表达模式，并利用双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰（RNAi）和透射电镜（TEM）证明，这两个LPMO15-1基因在蛹几丁质表皮周转中必不可少，对完成蛹-成虫蜕皮至关重要。

MATERIALS AND METHODS

昆虫

松墨天牛末龄幼虫购买并按先前描述的条件饲养。星天牛由韩国农村发展厅国立农业科学院提供。末龄幼虫在黑暗条件下，24°C和80%相对湿度下，用含有8.3%桑叶干粉的人工饲料饲养。在饲养条件下，松墨天牛和星天牛的成虫羽化分别发生在蛹化后约14天和13天。

MaLPMO15-1和PhLPMO15-1 cDNA的克隆

通过本地BLAST搜索松墨天牛和星天牛蛹转录组RNA序列的从头组装结果，分别鉴定了赤拟谷盗TcLPMO15-1（登录号：MZ636451）的直系同源物。为克隆MaLPMO15-1和PhLPMO15-1 cDNA，分别从松墨天牛14日龄蛹和星天牛13日龄蛹的总RNA中制备模板cDNA。使用基因特异性引物通过PCR扩增包含预测全长编码序列的cDNA，产物克隆到pGEM-T载体并测序。MaLPMO15-1和PhLPMO15-1克隆的GenBank登录号分别为PQ570466和PQ570467。

蛋白质序列分析

使用SignalP-6.0服务器分析信号肽编码区。LPMO结构域通过NCBI的保守结构域数据库（CDD）鉴定。使用ClustalW软件进行多序列比对。

系统发育分析

使用TcLPMO15-1蛋白作为查询，通过NCBI数据库BLAST搜索鉴定 well-annotated 昆虫基因组/转录组中的LPMO15-1样蛋白。使用ClustalW比对所有分析的LPMO15-1蛋白中高度保守的同源序列核心区域（包括AA15/LPMO15催化结构域），然后使用MEGA7程序的邻接法（Neighbour-joining）构建一致系统发育树。

实时定量PCR（qPCR）

为分析MaLPMO15-1和PhLPMO15-1在发育后期的表达模式，分别从松墨天牛和星天牛的年轻预蛹到5日龄成虫的全身提取总RNA并合成cDNA。使用 Thermal Cycler Dice real-time PCR system III 进行实时qPCR，以核糖体蛋白S6（MaRpS6和PhRpS6）作为内参基因标准化cDNA模板浓度。

RNA干扰（RNAi）

使用带有T7 RNA聚合酶识别序列的基因特异性引物通过PCR扩增dsMaLPMO15-1和dsPhLPMO15-1的模板，使用 AmpliScribe T7-Flash kit 合成dsRNA。将dsRNA（每头昆虫2μg）注射到松墨天牛和星天牛的末龄幼虫体内。合成增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的dsRNA（dsEGFP）作为阴性对照。通过qPCR分析RNAi后的基因敲低转录水平。

透射电子显微镜（TEM）

分析经dsRNA处理的昆虫的旧蛹表皮和新形成成虫表皮的超微结构。收集经dsMaLPMO15-1和dsPhLPMO15-1处理的预成虫，固定、脱水、LR white树脂渗透、包埋、超薄切片、醋酸铀染色后，使用JEOL JEM-1400 TEM成像。

数据分析

数据以至少三个独立重复的平均值±标准误（SEM）表示。使用Student t检验进行两组样本间差异的统计学分析。使用GraphPad Prism 10生成图表。

RESULTS AND DISCUSSION

MaLPMO15-1和PhLPMO15-1 cDNA的鉴定与测序

昆虫编码LPMO样蛋白的基因已被鉴定并归类为辅助活性家族15（AA15, LPMO15）成员。昆虫LPMO15蛋白家族本身可进一步分为至少四个主要亚组：I组（LPMO15-1）、II组（LPMO15-2）、III组（LPMO15-3）和IV组（鳞翅目特异性LPMO15）。I组LPMO15-1蛋白间氨基酸序列的高度保守性为从松墨天牛和星天牛中鉴定和克隆直系同源蛋白cDNA提供了机会。扩增的MaLPMO15-1和PhLPMO15-1 cDNA包含整个开放阅读框，分别长334和333个氨基酸。成熟蛋白（不包括预测信号肽）的理论分子量分别为35.7和35.6 kDa。与其他分析的I组LPMO15-1s成员一样，MaLPMO15-1和PhLPMO15-1都具有推定的信号肽、一个AA15结构域和一个C端富含半胱氨酸的基序，该基序包含两个6-半胱氨酸串联内部重复（C-X₁₅-C-X₃-C-X_6-7-C-X₄-C-X₁-C）。在保守的AA15结构域中，具有催化关键性的氨基酸残基，如两个组氨酸（对应于 Thermobia domestica TdAA15A中的His1和His91），它们以组氨酸支架结构配位铜离子；以及两个芳香族氨基酸酪氨酸和色氨酸（对应于TdAA15A中的Tyr24和Trp168），它们参与底物结合。系统发育分析显示，LPMO15-1s每个进化枝包含来自七个昆虫目（鞘翅目、双翅目、鳞翅目、膜翅目、等翅目、半翅目和直翅目）的代表。成熟 MaLPMO15-1 和 PhLPMO15-1 蛋白与其他鞘翅目直系同源物的氨基酸序列同一性分别为71%至96%和72%至97%。

MaLPMO15-1和PhLPMO15-1在发育后期的表达谱

为分析MaLPMO15-1和PhLPMO15-1在蛹化和成虫羽化过程中的功能，首先通过实时qPCR测定了从年轻预蛹到5日龄成虫后期发育阶段MaLPMO15-1和PhLPMO15-1转录本的丰度。这两个基因的表达模式非常相似，表明具有相同的生理功能。在幼虫-蛹蜕皮期间，在年轻预蛹期（YPP）检测到MaLPMO15-1和PhLPMO15-1的高转录水平。在蛹发育期间，这两个基因在早期蛹期（P0和P1）高表达，随后下降。

这两个基因在发育后期的时序表达模式与赤拟谷盗和飞蝗的直系同源物相似。在赤拟谷盗中，TcLPMO15-1的高转录水平在年轻预蛹（0-1日龄预蛹）和年轻蛹（0日龄蛹）中检测到，随后下降。在飞蝗中，LmLPMO15-1的高转录水平在4龄到5龄（倒数第二到末龄）若虫蜕皮前后观察到。值得注意的是，TcLPMO15-1和LmLPMO15-1主要在表皮形成组织（如去除中肠的躯干、体壁和气管）中表达，而不在中肠中表达。所有这些结果表明，在幼虫-蛹（倒数第二到末龄）蜕皮前后LPMO15-1的高表达在几种昆虫物种中是保守的，并且可能对后续发育所需的几丁质表皮周转至关重要。

通过RNAi敲低MaLPMO15-1和PhLPMO15-1转录本

为研究MaLPMO15-1和PhLPMO15-1在松墨天牛和星天牛中的生理功能，进行了dsRNA介导的基因沉默（RNAi）实验。注射dsEGFP作为阴性对照。首先通过实时qPCR分析RNAi后LPMO15-1基因的转录水平。将dsMaLPMO15-1和dsPhLPMO15-1分别注射到松墨天牛和星天牛的末龄幼虫体内，显著下调了在YPP期（注射后3-7天）和1日龄蛹（P1，注射后10-14天）的MaLPMO15-1和PhLPMO15-1转录本水平，而此时这两个靶基因通常高表达。

RNAi敲低MaLPMO15-1和PhLPMO15-1对幼虫-蛹和蛹-成虫蜕皮的影响

在松墨天牛中，向末龄幼虫注射dsMaLPMO15-1对随后的幼虫-蛹蜕皮没有影响，产生的蛹发育正常。然而，所有的预成虫都无法完成蛹-成虫蜕皮而死亡。它们显然经历了成虫羽化过程，包括沉积了新表皮，但无法完全蜕去蛹壳，蛹壳仍然附着在头部、胸部、触角、鞘翅和后翅上。

与在松墨天牛中RNAi敲低MaLPMO15-1所见类似，向星天牛末龄幼虫注射dsPhLPMO15-1后，在蛹-成虫蜕皮期间观察到发育停滞。预成虫无法完全蜕去旧蛹表皮，蛹壳仍然覆盖其头部、胸部、触角、鞘翅和后翅。这些结果表明，LPMO15-1是松墨天牛和星天牛蛹-成虫蜕皮所必需的。

自首次报道其在赤拟谷盗和飞蝗中的功能以来，尚无其他报告证明I组LPMO15-1在昆虫中的生理功能。在那两个物种中，通过RNAi导致LPMO15-1功能丧失均产生了致命的蜕皮缺陷。在飞蝗中，向1日龄5龄（末龄）若虫注射dsLmLPMO15-1导致成虫羽化失败。在赤拟谷盗中，RNAi敲低TcLPMO15-1根据dsTcLPMO15-1注射时间的不同，导致末龄幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹-成虫蜕皮缺陷。例如，正如在松墨天牛和星天牛中RNAi敲低LPMO15-1所见，用dsTcLPMO15-1处理的赤拟谷盗末龄幼虫能够蜕皮成蛹。然而，产生的蛹无法完成蛹-成虫蜕皮，死于被困在蛹壳内。在赤拟谷盗以及松墨天牛和星天牛中观察到的致死表型延迟到下一个蜕皮周期出现，可能是因为LPMO15-1在RNAi耗尽该酶的新转录本之前，已经氧化裂解/切断了在内表皮层沉积的结晶几丁质纤维，从而允许几丁质周转以确保随后的蜕皮。

MaLPMO15-1和PhLPMO15-1缺陷型昆虫表皮的超微结构

为分析LPMO15-1在松墨天牛和星天牛蜕皮过程中几丁质表皮周转的功能重要性，通过TEM分析了分别在其末龄幼虫阶段经dsMaLPMO15-1和dsPhLPMO15-1处理的预成虫（分别为14日龄和13日龄蛹）的旧蛹表皮和新形成成虫表皮的超微结构。在松墨天牛和星天牛中，dsEGFP处理的对照昆虫旧蛹表皮的内表皮（endocuticle）被大量降解。相比之下，dsMaLPMO15-1处理的昆虫显示内表皮几乎没有降解，水平几丁质片层（horizontal chitinous laminae）和垂直孔道（vertically oriented pore canals）基本保持完整。类似地，dsPhLPMO15-1处理的昆虫未能消化内表皮，大部分水平片层和垂直孔道保持完整。RNAi敲低LPMO15-1后内表皮层消化失败导致表皮显著增厚（分别为9.28 ± 0.37 μm和7.96 ± 0.30 μm），而相应的dsEGFP处理对照昆虫的表皮较薄（分别为4.92 ± 0.28 μm和2.44 ± 0.07 μm）。表皮（envelope）、上表皮（epicuticle）和电子致密的外表皮（exocuticle）在所有昆虫中均保持完整。这些结果表明，LPMO15-1是旧蛹内表皮周转所必需的，这对松墨天牛和星天牛完成蛹-成虫蜕皮至关重要。dsMaLPMO15-1和dsPhLPMO15-1处理的昆虫新形成成虫表皮的形态和厚度与各自的dsEGFP对照组相比没有明显差异。LPMO15-1似乎对这两种天牛新成虫表皮的形成和发育不是必需的。然而，未来需要进行更深入的分析，如更高放大倍数的研究和对发育过程中多个时间点表皮片层物理特性的量化来解决这个问题。

在赤拟谷盗中，如前所述，RNAi导致TcLPMO15-1功能丧失引起所有类型的蜕皮缺陷（幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹-成虫），其中旧表皮未被消化，不仅显示上表皮和外表皮层，而且显示未降解的内表皮层，呈现几乎完整的水平几丁质片层和垂直孔道。在飞蝗中RNAi敲低LmLPMO15-1后也出现类似的旧表皮周转和末龄若虫-成虫蜕皮缺陷。与在松墨天牛和星天牛中观察到的类似，在赤拟谷盗和飞蝗中通过RNAi耗尽LPMO15-1转录本对新形成表皮的形态没有影响。所有这些结果支持以下假设：1) LPMO15-1基因在许多昆虫物种中是保守的；2) 编码的酶在蜕皮过程中帮助消化旧表皮中的几丁质；3) 它不参与随后新表皮的形成沉积。

本研究通过RNAi和TEM研究了I组LPMO15-1在松墨天牛和星天牛中的生理功能，证明LPMO15-1是这两种森林害虫天牛几丁质表皮周转和蜕皮所必需的。先前的研究表明，另外两种几丁质分解酶——表皮I组（CHT5）和/或II组（CHT10）几丁质酶的功能丧失也会导致许多不同目昆虫的蜕皮停滞。此外，TEM分析揭示了在包括松墨天牛、赤拟谷盗和飞蝗在内的CHT缺陷型昆虫中旧表皮降解失败，表明这两组CHTs也在几丁质表皮周转中起作用。因此，本报告将扩展我们对昆虫蜕皮分子机制的理解，即除了CHT5和CHT10之外，LPMO15-1也对旧表皮中几丁质的降解以完成蜕皮至关重要。因此，昆虫表皮结晶几丁质很可能由LPMO、CHT和NAG组成的三元酶系统消化为N-乙酰氨基葡萄糖。此外，由于LPMO15-1基因在昆虫和其他节肢动物物种中的高度保守性，它及其编码的蛋白可能是控制害虫种群（包括松墨天牛和星天牛这两种蛀干森林害虫）的潜在靶点。