基于转录组分析探究珙桐（Davidia involucrata Baill.）响应干旱胁迫的分子机制

本研究通过转录组分析系统揭示珙桐（Davidia involucrata Baill.）响应干旱胁迫的分子调控网络，发现其通过“响应甘露醇（response to mannitol）”途径调节渗透平衡，并鉴定出三个土壤干旱相关通路基因（SDRPGs）。研究还发现不同光照条件下珙桐响应干旱的分子机制存在显著差异，且空气增湿可能通过调控ABA生物合成增强其抗旱性。该研究为珙桐的抗旱遗传改良及珍稀植物资源保护提供了重要候选靶点和理论依据。

　　

引言

全球变暖导致极端干旱事件频发，对农业和经济造成严重威胁。干旱胁迫是限制植物发育的重要非生物因素，严重影响植物生长。珙桐（Davidia involucrata Baill.）作为中国特有的孑遗树种，具有“植物活化石”之称，但由于气候变化和干旱频发，其自然分布范围逐渐缩小。珙桐繁殖能力弱且对环境胁迫高度敏感，因此亟需在分子水平深入了解其抗逆机制。

RNA测序（RNA-seq）技术作为转录组研究的关键高通量方法，已广泛应用于植物胁迫响应机制研究。本研究通过对干旱和非干旱条件下珙桐叶片组织进行RNA-seq分析，系统开展差异表达和功能富集分析，阐明珙桐对干旱胁迫的转录组响应，识别关键响应通路和调控网络。

材料与方法

RNA-Seq数据处理与定量

原始测序读数使用fastp进行质量控制，去除接头序列和低质量碱基，获得高质量clean reads。过滤后的reads使用HISAT2比对到GWHABJ00000000参考基因组，使用SAMtools将SAM文件转换为BAM格式并进行排序和索引。使用StringTie进行转录本定量，以参考基因组注释（GFF文件）指导组装和定量。

实验分组与差异表达分析

采用分组策略：Group_A（遮光干旱SaD vs 遮光湿润SaH）、Group_B（充足光照干旱ASaD vs 充足光照湿润ASaH）、Group_C（遮光干旱有雾SaD_F vs 遮光干旱无雾SaD_NF）。使用DESeq2 R包进行差异表达分析，筛选标准为|logFC| > 2且p值 < 0.05。

PCA与功能富集分析

基于差异表达基因（DEGs）进行PCA分析，评估组内样本分布和组间表达差异。对Group_A和Group_B的DEGs交集进行GO和KEGG富集分析，使用AnnotationForge R包构建珙桐特异性富集分析数据库。

目标通路的GSEA分析

重点关注与植物干旱胁迫响应相关的GO通路，在Group_A和Group_B中分别进行GSEA分析，筛选阈值为p值 < 0.05。

分子对接分析

基于关键通路DEGs的蛋白序列信息，使用SWISS-MODEL在线平台预测相应蛋白的三维结构。从PubChem数据库获取激素分子ABA和SA的三维结构，使用OpenBabel将SDF文件转换为PDB格式。使用AutoDock进行蛋白与激素分子的分子对接，选择结合自由能最低的构象作为最终对接结果。

空气增湿条件下的基因表达分析

对Group_C的DEGs进行GO富集分析，手动选择与植物干旱胁迫相关的生物过程（BP）通路进行进一步检查。随后对这些通路进行GSVA分析，评估其活性水平差异。

结果

DEGs鉴定

Group_A中SaD组与SaH组比较共鉴定出575个DEGs，其中307个下调基因和268个上调基因。Group_B中ASaD组与ASaH组比较发现472个DEGs，236个基因上调和236个下调。Group_C中SaD_F组与SaD_NF组比较共鉴定出701个DEGs，其中436个上调和265个下调基因。PCA分析显示基于DEGs表达，各比较组中实验组和对照组之间存在明显的组间差异和强烈的组内相似性。

重叠基因的功能富集分析

Group_A和Group_B的DEGs交集共获得82个重叠基因。GO富集分析显示这些基因主要富集在48个BP通路，包括"调节运输"、"激素运输"和"激素分解代谢过程"。CC通路富集24个术语，如"叶绿体类囊体腔"、"质体类囊体腔"和"类囊体腔"。此外还鉴定出10个MF通路，包括"UDP-葡萄糖基转移酶活性"、"糖基转移酶活性"和"葡萄糖基转移酶活性"。KEGG富集分析显示这些基因主要与酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及植物-病原体互作等通路相关。

Group_A和Group_B的GSEA分析

GSEA富集分析显示，"响应甘露醇"通路在Group_A的SaD和Group_B的ASaD中均显著上调，且在Group_A中上调更强。"UDP-葡萄糖基转移酶活性"、"葡萄糖基转移酶活性"、"UDP-糖基转移酶活性"、"槲皮素3-O-葡萄糖基转移酶活性"和"槲皮素7-O-葡萄糖基转移酶活性"在Group_B的ASaD中下调，在Group_A的SaD中上调，但这些差异无统计学意义（p值 > 0.05）。

土壤干旱相关通路基因的表达

提取所有参与上述通路的基因作为土壤干旱相关通路基因（SDRPGs），并检查它们在不同样本类型中的表达模式。与SaH组相比，Dinv08247、Dinv34952和Dinv00865在SaD组中显著上调；而与ASaH组相比，这三个基因在ASaD组中显著下调。

ABA/SA与SDRPGs结合相互作用的预测

分子对接分析显示，ABA和SA与SDRPGs编码蛋白的结合自由能均小于0，表明结合亲和力良好。其中ABA与Dinv34952蛋白的结合自由能最低，为-4.14 kcal/mol，而SA与Dinv00865蛋白的结合自由能最低，为-3.33 kcal/mol。具体而言，Dinv34952 A链第207位氨基酸（天冬氨酸）的氢原子与ABA分子中的氧原子形成氢键。此外，Dinv00865 A链第145位氨基酸（赖氨酸）的氢原子与SA分子中的氧原子形成氢键。

空气增湿在缓解珙桐干旱胁迫中的作用分析

Group_C的DEGs主要富集在16个BP通路，包括"细胞对脱落酸刺激的反应"、"萜类代谢过程"和"脱落酸激活信号通路的负调控"。这些通路的GSVA富集分析显示，"肌醇磷酸生物合成过程"、"肌醇六磷酸生物合成过程"和"肌醇六磷酸代谢过程"在未增湿空气组中显著上调。相反，"萜烯生物合成过程"、"萜烯代谢过程"、"脱落酸激活信号通路的负调控"、"脱落酸激活信号通路的调控"、"细胞对脱落酸刺激的反应"和"根发育的调控"通路在未增湿空气组中显著下调。

讨论

本研究通过生物信息学方法深入分析了珙桐的转录组数据，阐明其对干旱胁迫的响应机制。通过差异表达分析，共鉴定出82个在不同光照强度条件（遮荫和高光）下响应珙桐干旱胁迫的基因。进一步的GSEA显示，共同激活的通路是"响应甘露醇"。甘露醇作为渗透保护剂在渗透胁迫条件下发挥作用，干旱条件下甘露醇的积累可以保护植物免受干旱胁迫。

值得注意的是，珙桐对干旱胁迫的响应在不同光照强度条件下存在差异。在遮荫条件下，糖基转移酶相关通路呈现上调趋势，表明珙桐可能通过糖基化修饰机制增强细胞保护以减轻干旱胁迫造成的损害。糖基转移酶可以作用于植物激素、次级代谢产物和各种其他内源性化合物，通过增强底物的活性和稳定性来提高植物对非生物胁迫的抗性。

在高光和干旱胁迫联合条件下，与遮荫条件相比，珙桐的糖基转移酶相关通路显著下调。我们推测在高光条件下，植物可能需要快速分配能量资源用于抗氧化防御以减轻对光合机构的损害，从而暂时抑制糖基化过程以节约能量和资源来应对更直接的高光胁迫威胁。

SDRPGs（Dinv08247、Dinv34952和Dinv00865）的表达模式分析显示，所有这些基因在不同条件下都表现出显著的差异表达。与SaH组相比，这些基因在SaD组中显著上调，表明珙桐可能在遮荫条件下通过增强糖基化相关功能来响应干旱胁迫。然而，与ASaH组相比，这些基因在ASaD组中显著下调，表明在高光条件下，珙桐可能抑制糖基化相关通路活性以重新分配资源来快速响应高光胁迫的更不利影响。

许多植物激素有助于耐旱性，其中ABA是研究最广泛和应用最广泛的。ABA通过减少植物蒸腾作用来调节气孔关闭和增强抗旱性。分子对接分析显示，ABA与SDRPGs编码蛋白的结合自由能均小于0，ABA与Dinv34952的结合最稳定。值得注意的是，对接结果显示这种相互作用涉及天冬酰胺（ASN）残基，让人联想到ABA与其在植物中的关键受体PYL9之间的相互作用。这些结果为我们的假设提供了初步支持。

SDRPGs的注释表明干旱胁迫导致糖基化相关通路的激活，表明植物可能正在经历氧化胁迫。SA是一种植物激素，具有抗氧化特性，也在调节气孔行为中发挥作用。本研究发现SA与SDRPGs编码蛋白结合，与Dinv00865的相互作用最稳定，表明SA也可能有助于珙桐的耐旱性。

对各种环境条件下珙桐的观察表明，空气增湿显著减轻了干旱胁迫对植物生长的不利影响。通过比较有和无空气增湿条件下珙桐的转录组数据，本研究发现未增湿组显著激活了肌醇磷酸代谢相关通路。肌醇磷酸及其衍生物作为第二信使参与干旱信号的传递，并调节各种生理过程，包括细胞内Ca²⁺浓度、ROS水平和激素信号转导。

相比之下，在空气增湿处理下，珙桐表现出另一种响应模式，显著激活了"萜烯生物合成过程"、"萜烯代谢过程"、"脱落酸激活信号通路的负调控"、"脱落酸激活信号通路的调控"、"细胞对脱落酸刺激的反应"和"根发育的调控"等通路。空气增湿可能通过增强ABA信号通路的感知来促进根生长，从而缓解珙桐的干旱胁迫，同时精细调节ABA的产生以防止其过度积累和相关植物生长抑制。此外，萜类代谢通路的激活可能为植物提供额外的抗氧化保护，补充空气增湿的效果。