CASP16中RNA唯一样本的RNA-Puzzles评估：三维结构预测进展与挑战

本综述系统评估了CASP16中RNA唯一样本的三维结构预测结果，采用RNA-Puzzles建立的标准化评估体系（包括INF、RMSD、TM-score、lDDT等指标），揭示了当前预测方法在全局折叠精度、非沃森-克里克配对（non-Watson–Crick pairs）和立体化学准确性方面的突破与局限，为RNA结构预测领域的算法优化和功能研究提供了重要基准。

　　

1 引言

2024年举行的第十六届蛋白质结构预测关键评估（CASP16）在多个方面与往届不同：目标RNA数量显著增加、结构复杂度更高（如出现多聚体和大分子量RNA）、近半数目标在现有数据库（如RFAM、PDB）中无同源结构，且多数结构数据来源于冷冻电镜（cryo-EM）而非X射线晶体学。冷冻电镜技术的飞速发展使得从tRNA到大于组II内含子的RNA结构均可在数周内解析，甚至达到2.0–2.5?的分辨率。与此同时，人工智能（AI）和基于大语言模型的工具正快速发展，但同时也带来了模型记忆效应问题——已见过的结构无法从AI记忆中抹去。

RNA结构预测的本质逐渐趋近于“三维逆折叠问题”：即给定序列应匹配何种结构。尽管RNA的二维逆折叠研究较多，三维层面的研究仍较为有限。RNA核苷酸具有明显的构象偏好性（如C3′-内型糖环、反式碱基、gauche+的O5′构象等），但1–5个核苷酸的短序列仍可采取多种构型，这导致无连接核苷酸的螺旋连接较易组装，而含多个螺旋间核苷酸的连接则较难，这一点在CASP15中人设计序列的预测中已得到验证。

2 方法

评估采用RNA-Puzzles建立的“相互作用网络保真度”（Interaction Network Fidelity, INF）标准，该指标整合了沃森-克里克配对（WC）、非沃森-克里克配对（NWC）和碱基堆积（STACK）三个参数，并使用MC-Annotate进行非标准配对识别，依照Leontis-Westhof命名法进行二维图注释。计算中评估了真阳性（TP）、假阳性（FP）和假阴性（FN），并通过马修斯相关系数（MCC）计算INF值。此外还采用：

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  变形指数（Deformation Index）：INF与RMSD的比值；
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  变形谱（Deformation Profile）：以逐个核苷酸为单位的局部RMSD矩阵，用于识别结构偏差区域；
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  MolProbity的Clash score：评估立体化学和内部几何；
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  MAXIT：检查手性违规（如核糖C4′或C1′构型错误）；
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  TM-score和lDDT：分别作为全局和局部结构相似性度量。

预测分为人工参与建模和全自动服务器预测两类，但目前服务器预测数量仍较少，难以进行方法间比较。所有评估数据、代码和流程均公开于www.rnapuzzles.org。

3 结果

3.1 评估指标间的相关性分析

INF_all与lDDT相关性较好，与TM-score相关性较弱；lDDT与GDT、TM-score均呈良好线性相关。当GDT>40或TM>0.4时，INF_all多处于0.7–0.8之间。GDT与RMSD相关性较高，而TM-score较差。RMSD超过20?、GDT<40、TM<0.4或INF_all<0.7的模型区分度较低。

3.2 各目标的评分分布

在34个目标中，10个目标的模型RMSD超过10?，8个在5–10?之间，16个低于5?。许多模型不仅RMSD高（>60?）、TM-score低（<0.4），还存在立体化学冲突（Clash score>100）。甚至包括已发表结构的目标（如ZMP核糖开关、HYER组II核酶等）也表现不佳。约三分之一提交模型存在手性违规，涉及64%的参赛组。在剔除RMSD>60?和Clash>100的模型后（占总数10%），分析集中于剩余样本。

3.3 典型目标深度分析

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  R1212（FanzorRNA引导核酸酶部分）：虽长度不长，但因含假结和复杂三维互作而难度高。最佳模型RMSD为8.2?（TS063团队），但3′区域仍存在偏差；
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  R1288（体外筛选核酶）：是三向连接结构（type A），核心非沃森-克里克配对网络复杂。最佳模型RMSD为5.4?（TS481），但关键反应位点A52未正确安置，且C11=G34配对未能预测；
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  R1285/OLE RNA：形成同源二聚体，单体折叠较为成功（最佳RMSD=6.7?，TM=0.7），双链环-环互作空间位置正确；
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  R1293（病毒翻译增强子）：含平行链碱基配对等非经典结构。仅TS063团队接近实验结构（RMSD=4.6?），但TM仅0.5。

3.4 参赛团队对比分析

65支团队中27支从未进入前五名。排名靠前的团队包括：

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  TS481（美国密苏里大学Shi-Jie Chen团队，使用Vfold方法）；
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  TS183（广州中山大学黄林团队，结合多种工具与人工修正）；
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  TS063（波兰波兹nan研究所，RNAComposer工具）；
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  TS304（AlphaFold3服务器，排名第七）。

独立运行AlphaFold3的结果略低于参赛版本，与R. Das等人的评估结论一致。

4 结论

4.1 化学精度普遍不足

许多模型存在立体化学违规（如核糖C4′构型错误），甚至包括传统建模方法和AI工具（如TS317）。虽低精度高准确度模型比高精度低准确度模型更有功能解释价值，但最终模型仍需符合化学约束。

4.2 全局折叠不足以捕捉功能关键特征

虽全局折叠常可实现，但单链区域（如铰链区、环区）的核苷酸空间排列和互作网络常未能正确预测，而这些区域恰是功能（如蛋白质结合、催化）的关键。结构基础上的多序列比对可揭示进化中保守的互作架构。

4.3 大分子RNA预测难度加剧

如组I/II内含子等大于400nt的目标中，部分团队表现优异（如R1241中TS481模型：INF_all=0.85, TM=0.88），但整体分布广泛，同源结构映射能力不稳定。

4.4 缺乏统一评估标准

当前评分函数多基于原子坐标而非残基间接触，且多源于蛋白质评估体系。INF是唯一针对核酸碱基配对和堆积的指标，但在低质量模型中判别力不足。

4.5 暂无单一主导预测方法

成功方法多基于知识库、特化力场和统计模型，并结合人工专家干预。深度学习应用仍较少，且效果依赖目标类型和专家经验。

4.6 未来方向：进化指导与AI融合

应发展进化指导的建模方法，将结构基础的多序列比对整合进建模流程并迭代调整。结合物理原理与AI从大数据中提取的折叠规则，才能提升预测成功率——正如Dobzhansky所言“生物学中一切唯有在进化之光下才有意义”，而建模的终极目标是“洞察而非模型”。