土壤样本蛋白质定量优化：基于样本特异性Lowry校正的高通量精准测定新策略

本综述系统探讨了土壤蛋白质定量中的干扰问题，重点介绍了基于Lowry法的样本特异性校正策略。通过建立多元回归模型（Multivariate Regression, MV），有效校正了腐殖质等干扰物质的影响，实现了与总水解氨基酸（THAA）和Qubit蛋白检测法相当的结果。该方法仅需4个样本即可完成模型校准，为土壤蛋白质组学（Metaproteomics）研究提供了高效、可靠的高通量解决方案。

　　

土壤样本蛋白质定量优化研究

摘要

土壤蛋白质分析对于理解土壤生态系统功能和指导可持续土壤管理实践具有重大意义。然而，土壤复杂基质中的多种干扰物质（如酚类和腐殖质）严重影响蛋白质定量结果的准确性。本研究针对Lowry法在土壤蛋白质定量中的干扰问题，开发了一套样本特异性校正方法，并通过与总水解氨基酸测定法和Qubit蛋白检测法的对比验证了其可靠性。

引言

随着土壤生态系统面临的压力日益增大，土壤健康问题引发广泛关注。土壤蛋白质组学（Metaproteomics）作为研究复杂样本中蛋白质功能与分类归属的新兴领域，为揭示生态系统功能提供了独特视角。然而，基于染料、荧光团或显色复合物的蛋白质定量方法易受土壤基质中酚类、腐殖质等物质的干扰。

传统的Lowry法虽然成本低、操作简便，但其与多种有机化合物的非特异性反应导致蛋白质含量被高估。现有校正方法多基于清洁基质或模型干扰物质建立，难以适用于真实环境样本。本研究旨在：1）建立环境基质中蛋白质定量干扰的评估框架；2）比较样本特异性校正与清洁基质校正的差异；3）将校正后的Lowry法与总水解氨基酸法和Qubit法进行对比。

材料与方法

研究采用两种有机质丰富的矿质草地土壤（Grange和Athenry）作为样本，分别设置了三种土壤处理条件和三种提取缓冲液（水、中性焦磷酸钠NaPPi、碱性NaPPi），共18种处理组合。蛋白质提取采用超声辅助提取法，浓缩后使用3000 Da分子量截留超滤离心管进行浓缩。

Lowry法蛋白质定量采用脱氧胆酸钠-三氯乙酸（DOC-TCA）沉淀法纯化样本，并优化了微孔板检测方案。同时测量含铜（吸光度A）和不含铜（吸光度B）条件下的吸光度值，通过蛋白质加标系列（0、50、100 μg mL^-1 BSA）建立校正曲线。

总水解氨基酸（THAA）定量采用Jones等人的方法，使用茚三酮试剂在570 nm处检测。Qubit蛋白检测法则按照制造商方案进行，样本稀释10倍以降低土壤干扰。

数据分析采用普通最小二乘线性回归和多元回归方法，使用R语言进行统计分析和可视化。

结果

样本特异性Lowry校正方法的开发

在环境基质中，由于环境蛋白质和干扰物质的共存，吸光度A和B的回归线交点不再对应于零添加数据点。通过三角测量法计算吸光度A和B回归线的交点，可定量干扰物质含量，进而通过扣除干扰背景获得校正后的蛋白质吸光度。

研究提出了三种样本特异性校正方法：1）"交点法"：通过回归线交点和y轴截距计算干扰背景；2）"斜率比法"：基于样本基质中蛋白质标准的斜率比计算校正因子；3）"多元回归法"：使用参考蛋白质含量值校准Lowry吸光度A和B的校正因子。

Lowry法干扰校正方法的比较

所有校正方法均报告低于未校正吸光度A的蛋白质估计值，且随着干扰物质浓度的增加，校正与未校正值之间的差异更加明显。Potty方法报告的蛋白质含量最低，而Winters和Minchin方法报告的校正蛋白质估计值最高。样本特异性校正方法1版本2（Intersect V2）与清洁基质校正方法趋势相似但数值更高。

斜率导出的校正因子在清洁基质和研究间存在差异，突显了实验室特异性校准的必要性。环境基质中的校正因子大多高于清洁基质，但Athenry土壤碱性NaPPi提取物除外，其高背景干扰可能影响了蛋白质添加斜率的测量。

多元回归校正Lowry法与其它方法的比较

与总水解氨基酸和Qubit检测法相比，多元回归校正的Lowry法（MV Global）能有效account for干扰。净水解氨基酸（net HAA）显示的氨基酸浓度高于校正后的Lowry和Qubit估计值，可能源于非蛋白质氨基酸来源（如氨基糖）或使用BSA当量量化土壤提取蛋白质的偏差。

多元模型的校准和预测质量

通过随机降采样测试表明，使用最少4个样本即可获得高质量的预测模型（R² > 0.94）。使用单一校正方法（斜率比法）进行校准时，预测R²虽不如使用所有Lowry校正方法的平均值作为参考时高，但仍可获得可靠结果。

讨论

本研究提出了环境基质中Lowry法干扰的量化框架，并开发了一套新颖的蛋白质校正方法。所有校正方法均报告低于未校正Lowry法的蛋白质估计值，且差异随干扰物质浓度增加而加剧。

清洁基质校正因子在不同研究间的差异可能源于：1）Lowry法实施细节的差异（试剂、孵育条件等）；2）试剂中可能存在微量铜。这表明在使用清洁基质推导的校正因子时，需要进行实验室特异性校准。

环境基质中，吸光度B的斜率可能因残留或环境铜的存在而增加，或因高干扰物质含量而敏感性降低。吸光度A的斜率可能因螯合物质（如邻二酚）而减少，导致蛋白质浓度被高估。

多元回归法为Lowry法校正因子的通用校准指明了方向，其参考值可来自更精确的蛋白质定量方法（如氨基酸分析或近红外光谱）。本研究开发的MV Global校正方法显示出平衡的趋势和蛋白质估计值分布。

与其它蛋白质定量方法相比，净水解氨基酸可能因非蛋白质氨基酸来源或使用BSA当量而产生偏差。游离氨基酸（FAA）浓度最低，可能反映了土壤微生物对易分解组分的快速利用。

结论

本研究描述了Lowry法样本特异性干扰的理论和实践基础。推荐采用多元回归方法，通过更精确的蛋白质分析技术在较小测试集上校准Lowry法校正因子，或使用样本特异性校正方法生成跨土壤/植物/生态背景的更广泛校正因子。该策略有望促进Lowry法在高干扰物质含量的植物和环境提取物中的应用。

本研究得到爱尔兰研究委员会的资助，作者声明无利益冲突。