超声-微波协同提取桑葚花色苷：优化工艺、增强抗氧化活性及抑制乳腺癌4T1细胞机制研究

本研究首次采用超声-微波协同萃取技术（UMAE）优化桑葚花色苷（MA）提取工艺，通过响应面法（RSM）确定最佳参数（料液比1:20，乙醇浓度80%，超声功率340W），获得高达5.98mg/g的提取率。实验证实MA具有显著抗氧化活性（对DPPH·、ABTS·和·OH自由基清除能力强于VC），并能剂量依赖性地抑制4T1乳腺癌细胞增殖、迁移并诱导凋亡，为桑葚功能性开发提供理论依据。

　　

1 引言

桑葚（Mulberry）作为药食同源植物，富含花色苷、黄酮类和多酚酸等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能。传统溶剂提取法存在效率低、耗时长、试剂消耗大等问题，且花色苷的热不稳定性导致其在提取过程中易降解。超声辅助萃取（UAE）和微波辅助萃取（MAE）因其高效、低温、保留活性等优势被广泛应用于植物活性成分提取领域。超声-微波协同萃取技术（UMAE）结合超声波空化效应和微波热效应，可有效破坏植物细胞壁，提高提取效率。本研究首次采用UMAE技术结合响应面法（RSM）优化桑葚花色苷（MA）提取工艺，并系统评价其抗氧化活性和对4T1乳腺癌细胞的抑制机制。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

桑葚果实购自广东珠海农副产品批发物流中心，于-20°C保存。实验所用乙醇、盐酸、乙腈等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。DPPH·、ABTS·、·OH自由基检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，CCK8试剂盒购自碧云天生物技术公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Solarbio公司。细胞培养所用RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液购自Gibco公司。

2.2 花色苷的提取与纯化

桑葚果实经清洗、打浆后，真空冷冻干燥72小时。取500g桑葚浆料，采用1% HCl-70%乙醇（1:99, v/v）作为提取溶剂，在避光条件下使用超声-微波协同萃取仪（XH-300A型）进行提取。提取后的样品在5000rpm下离心10分钟，收集上清液并用酸性乙醇定容，获得粗提物。采用AB-8大孔树脂对粗提物进行吸附纯化，经浓缩干燥后得到纯化的桑葚花色苷（MA）。

2.3 单因素实验

通过单因素实验系统考察料液比（1:5–1:25 g/mL）、超声功率（100–500W）、乙醇浓度（40%–100%）、微波功率（200–400W）、提取时间（20–60分钟）和pH值（0.5–4.5）对MA提取率的影响。所有实验均设3个重复。

2.4 响应面法优化提取工艺

基于单因素实验结果，采用Box-Behnken设计（BBD）进行3因素3水平的响应面优化实验。以料液比（A）、乙醇浓度（B）和超声功率（C）为自变量，花色苷提取率为响应值，利用Design-Expert软件（v13.0）进行模型拟合与分析。

2.5 总花色苷含量测定

采用pH示差法测定总花色苷含量，分别在520nm和700nm波长下测定吸光度值，以矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）当量表示含量，计算公式为：

花色苷含量（mg/g）= (A × MW × DF × V) / (ε × W × L)

其中A为吸光度差值，MW为C3G分子量，DF为稀释因子，V为体积，ε为C3G摩尔消光系数，W为样品质量，L为光程。

2.6 体外抗氧化活性测定

2.6.1 DPPH·自由基清除能力

将MA和VC配制成3.125–50μg/mL系列浓度，取2.0mL样品溶液与2.0mL DPPH溶液混合，避光反应30分钟后测定517nm处吸光度。清除率计算公式：

DPPH·清除率(%) = [1 - (A₁ - A₂) / A₀] × 100%

其中A₁为样品组吸光度，A₂为样品本底吸光度，A₀为DPPH溶液吸光度。

2.6.2 ABTS·自由基清除能力

将ABTS溶液与过硫酸钾混合，4°C避光放置12小时生成ABTS·自由基工作液。取0.1mL不同浓度MA或VC溶液，加入1.9mL ABTS·工作液，反应15分钟后测定734nm处吸光度。清除率计算公式：

ABTS·清除率(%) = [1 - (A₁ - A₂) / A₀] × 100%

其中A₀为无水乙醇代替样品的吸光度。

2.6.3 羟基自由基清除能力

采用邻二氮菲-Fe²⁺氧化法测定·OH清除能力。取不同浓度MA溶液（3.125–50μg/mL），加入邻二氮菲、FeSO₄和H₂O₂，反应后测定536nm处吸光度。清除率计算公式：

·OH清除率(%) = (A₁ - A₂) / (A₀ - A₂) × 100%

其中A₁为样品组吸光度，A₂为损伤组吸光度，A₀为未损伤组吸光度。

2.7 桑葚花色苷对4T1细胞活性的影响

2.7.1 细胞培养

4T1小鼠乳腺癌细胞在含9% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。

2.7.2 细胞毒性检测（CCK8法）

将4T1细胞以1×10⁵ cells/mL密度接种于96孔板，分别加入0.1–2mg/mL浓度的MA溶液，培养24小时后加入CCK8试剂，测定450nm处吸光度计算细胞抑制率：

抑制率(%) = (OD₂ - OD₁) / OD₂ × 100%

其中OD₁为给药组吸光度，OD₂为空白对照组吸光度。

2.7.3 细胞形态学观察

取对数生长期4T1细胞接种于24孔板（2×10⁵/孔），分别加入0.25、0.5、1mg/mL MA溶液，培养24小时后在倒置光学显微镜下观察并拍摄细胞形态变化。

2.7.4 细胞划痕实验

将4T1细胞以1×10⁶ cells/mL密度接种于6孔板，用枪头划出均匀划痕，加入不同浓度MA（0.25、0.5、1mg/mL）培养24小时，观察细胞迁移情况并计算迁移率：

迁移率(%) = (W₀ - W₁) / W₀ × 100%

其中W₀为初始划痕宽度，W₁为培养后划痕宽度。

2.7.5 细胞凋亡检测

将4T1细胞以4×10⁵/mL密度接种于6孔板，用0.25、0.5、1mg/mL MA处理24小时后，采用Annexin V-FITC/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，使用Flow Jo软件（v10.8.1）分析结果。

2.8 数据处理与统计分析

所有实验结果以均值±标准差表示，采用SPSS软件（v17.0）进行单因素方差分析（ANOVA）和t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

单因素实验结果表明，料液比为1:20 g/mL时提取效果最佳，过高料液比会导致溶剂饱和反而降低提取效率；超声功率为400W时提取率达5.6mg/g，500W时略有下降，可能与局部温度升高导致花色苷降解有关；70%乙醇浓度提取效果最好（5.2mg/g），过高乙醇浓度会降低溶剂极性而影响花色苷溶解度；微波功率350W时提取率最高（4.7mg/g），过高功率会导致热降解；超声时间20分钟时提取率最高（5.5mg/g），延长处理时间反而降低提取量；pH 2.5时提取效果最佳（5.3mg/g），碱性条件会导致花色苷结构破坏。

3.2 响应面模型建立与方差分析

通过Box-Behnken设计建立二次多项式回归模型，方差分析显示模型极显著（p<0.0001），失拟项不显著（p>0.05），模型拟合度良好（R²=0.9845）。一次项A（料液比）、B（乙醇浓度）、C（超声功率）和二次项A²、B²、C²均达到极显著水平（p<0.01），表明该模型能有效预测MA提取工艺。

3.3 响应面优化与验证

响应面分析显示，各因素对MA提取率的影响顺序为：料液比>乙醇浓度>超声功率。通过模型预测得到最优提取条件为：料液比1:20、乙醇浓度80%、超声功率340W。在此条件下进行验证实验，MA提取率达5.98mg/g，与预测值高度吻合，表明优化结果可靠。与传统提取方法相比，UMAE法提取率显著高于溶剂提取法（1.2mg/g）、超高压提取法（1.97mg/g）和酶辅助提取法（6.04mg/g），证明UMAE是一种高效的MA提取方法。

3.4 体外抗氧化活性

抗氧化实验表明，MA对DPPH·、ABTS·和·OH自由基均具有显著的浓度依赖性清除能力。当浓度达50μg/mL时，MA对DPPH·的清除率超过95%；在3μg/mL时对ABTS·的清除率即达98%以上；特别值得注意的是，MA对·OH的清除能力显著优于VC，在0.1μg/mL浓度下清除率即可达97%。这些结果证实MA具有强大的抗氧化能力，其机制可能与提供氢原子中和自由基孤对电子有关。

3.5 对4T1细胞活力的影响

CCK8实验显示，MA对4T1细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用。低浓度区间（0.1-0.8mg/mL）细胞活力保持较高水平，抑制作用较弱；随着浓度增加（1-2mg/mL），细胞存活率显著下降，表明MA可能通过诱导氧化应激或干扰细胞周期来发挥抗肿瘤作用。

3.6 对4T1细胞形态的影响

细胞形态学观察发现，250μg/mL MA处理组细胞密度降低但形态无明显变化；500μg/mL组部分细胞出现聚集和凋亡特征；1000μg/mL组细胞明显聚集、形态不规则、细胞膜破裂，密度显著降低。这些形态学变化表明MA能诱导4T1细胞发生典型的凋亡性改变。

3.7 对4T1细胞迁移的影响

划痕实验结果表明，除250μg/mL组对细胞侵袭抑制显著（p<0.001）外，其余浓度组均呈现极显著抑制作用（p<0.0001）。随着MA浓度增加，细胞愈合率逐渐降低，1000μg/mL时愈合率最低。证明MA能有效抑制4T1细胞的迁移和侵袭能力。

3.8 对4T1细胞凋亡的影响

流式细胞术检测显示，空白组细胞凋亡率极低；0.25mg/mL MA处理组早期和中期凋亡细胞显著增加；随着浓度升高，细胞凋亡率逐渐上升，表明MA能剂量依赖性地诱导4T1细胞凋亡。这可能通过激活Caspase-3酶、诱导DNA fragmentation以及调节Bcl-2/Bax通路实现。

4 结论

本研究成功建立超声-微波协同萃取桑葚花色苷的优化工艺，最佳条件为料液比1:20、乙醇浓度80%、超声功率340W，提取率达5.98mg/g。实验证实MA具有卓越的抗氧化活性，能有效清除DPPH·、ABTS·和·OH自由基，且对4T1乳腺癌细胞具有浓度依赖性的增殖抑制、形态改变、凋亡诱导和迁移抑制作用。这些发现为桑葚花色苷在功能食品和医药领域的开发应用提供了坚实的理论依据和实践指导。后续研究将聚焦于MA抗乳腺癌的具体分子机制，以期实现更好的抗癌效果。