爱德华菌T3SS效应蛋白EseJ通过抑制PANoptosome组装调控巨噬细胞多重程序性死亡的新机制

本研究揭示了爱德华菌（Edwardsiella piscicida）III型分泌系统效应蛋白EseJ通过激活TAK1磷酸化，抑制NLRP3-caspase-8-RIPK1 PANoptosome组装，从而同时抑制细胞焦亡(pyroptosis)、凋亡(apoptosis)和坏死性凋亡(necroptosis)的分子机制。该发现为病原菌免疫逃逸策略提供了新见解，对水产养殖病害防治具有重要指导意义。

　　

在水产养殖业中，爱德华菌（Edwardsiella piscicida）引起的出血性败血症一直是个棘手难题。这种革兰氏阴性病原菌不仅能感染鱼类，近年来在人类感染病例中也呈现上升趋势。更令人担忧的是，它还能巧妙地操纵宿主细胞的死亡程序来促进自身存活和复制。巨噬细胞作为免疫系统的第一道防线，通常通过启动程序性细胞死亡来清除胞内病原体，但爱德华菌却能让这些免疫细胞"自杀未遂"。

以往研究发现，爱德华菌的III型分泌系统（T3SS）效应蛋白EseJ具有双重功能：既作为调节因子抑制1型菌毛表达，又作为效应蛋白促进细菌在宿主细胞内的复制。然而，科学家们观察到一种有趣的现象——感染初期细胞呈现凋亡特征的圆缩，随后却转变为焦亡样的细胞破裂。这种细胞死亡模式的转换背后隐藏着怎样的分子机制？EseJ在其中又扮演什么角色？这些问题激发了研究团队的探索欲望。

为了揭开谜底，研究人员开展了一系列精巧的实验。他们首先通过蓝曼龙鱼感染实验发现，缺失EseJ的菌株毒力显著减弱，特别是在感染早期阶段，这表明EseJ在病原菌建立感染过程中起着关键作用。

研究采用的主要技术方法包括：利用小鼠巨噬细胞系J774A.1进行细菌感染实验，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放试验和碘化丙啶（PI）染色评估细胞毒性；使用蛋白质免疫印迹分析关键细胞死亡相关蛋白的活化状态；采用药理学抑制剂（如caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk、NLRP3抑制剂MCC950等）进行功能阻断实验；通过免疫共沉淀技术检测PANoptosome复合物的组装；使用慢病毒介导的RNA干扰技术敲低caspase-8和NLRP3表达；并利用蓝曼龙鱼感染模型进行体内毒力评估。

EseJ抑制小鼠巨噬细胞焦亡

研究人员发现，感染缺失EseJ的菌株（ΔeseJ）后，小鼠巨噬细胞出现明显的细胞肿胀和膜破裂现象。PI染色显示ΔeseJ感染组PI阳性细胞比例（29.8±6.1%）显著高于野生株（15.8±4.0%）和回补株（8.9±3.0%）。LDH释放实验进一步证实了这一发现。免疫印迹分析显示，ΔeseJ感染组中cleaved caspase-1（p20）和cleaved GSDMD水平显著升高，表明EseJ能抑制caspase-1和GSDMD的活化。值得注意的是，当进一步缺失T3SS ATP酶基因esaN时，这种促焦亡效应被消除，说明EseJ的抑制作用依赖于功能性T3SS。

EseJ通过失活caspase-8和NLRP3炎症小体抑制焦亡

研究发现，用caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk预处理巨噬细胞，可显著降低ΔeseJ感染引起的caspase-1和GSDMD切割。形态学观察显示，感染1小时后ΔeseJ感染组细胞出现凋亡特征性圆缩，3小时后则出现焦亡样细胞破裂，而这种PI摄取可被caspase-8抑制剂抑制。即使在缺失1型菌毛（ΔfimH）的情况下，EseJ仍能通过失活caspase-8来抑制焦亡。NLRP3抑制剂MCC950处理也能显著降低cleaved caspase-1、cleaved caspase-8和cleaved GSDMD水平，并减少PI阳性细胞比例。通过慢病毒介导的caspase-8或NLRP3敲低实验进一步证实，EseJ介导的caspase-1活化抑制依赖于caspase-8和NLRP3。

EseJ抑制NLRP3-caspase-8-RIPK1 PANoptosome介导的PANoptosis

研究显示，EseJ还能抑制坏死性凋亡。感染ΔeseJ菌株后，磷酸化MLKL（p-MLKL）水平显著升高，而回补EseJ后则恢复正常。用RIPK3抑制剂GSK'872预处理可显著降低cleaved caspase-1水平并消除p-MLKL，但同时增加了cleaved caspase-3水平，表明RIPK3在调节ΔeseJ感染刺激的凋亡、焦亡和坏死性凋亡中起关键作用。机制上，EseJ translocation显著增加了TAK1磷酸化水平。免疫共沉淀实验发现，感染ΔeseJ菌株后，NLRP3与caspase-8或RIPK1的相互作用显著增强，表明EseJ能抑制NLRP3-caspase-8-RIPK1 PANoptosome的组装。

研究还发现，EseJ能促进IL-1β分泌。感染表达EseJ的菌株后，J774A.1细胞中IL-1β分泌显著增加，这可能是一种免疫调节策略，使细菌在抑制细胞死亡的同时适度激活炎症反应，有利于建立持续性感染。

这项研究揭示了爱德华菌T3SS效应蛋白EseJ通过多层面调控宿主细胞死亡通路的新机制。EseJ不仅能通过下调1型菌毛抑制caspase-8介导的凋亡，还能在侵入细胞后通过激活TAK1磷酸化，抑制NLRP3-caspase-8-RIPK1 PANoptosome组装，从而同时抑制焦亡、凋亡和坏死性凋亡（PANoptosis）。这种多重细胞死亡通路的协同抑制为爱德华菌的细胞内生存和复制创造了有利环境。

该发现不仅深化了我们对病原菌与宿主相互作用机制的理解，也为开发新型抗感染策略提供了思路。针对EseJ介导的细胞死亡抑制通路，可能设计出阻断细菌免疫逃逸的新方法。同时，这项研究为其他病原菌的类似机制提供了参考框架，对水产养殖病害防治和人类相关感染疾病的治疗都具有重要意义。

论文发表于《Communications Biology》，展示了中国科学院水生生物研究所何天天、唐浦煜等科研人员在病原菌与宿主相互作用领域的重要突破，为程序性细胞死亡研究提供了新的视角和理论基础。