单细胞转录因子测序技术揭示转录因子剂量调控细胞重编程异质性的新机制

研究人员为解析细胞重编程异质性机制，开发了单细胞转录因子测序（scTF-seq）技术，通过诱导条形码化的多西环素调控转录因子过表达并量化剂量依赖性转录组变化。研究在小鼠胚胎多能间充质干细胞中构建了384个转录因子的功能获得性图谱，揭示了剂量依赖与随机性细胞状态转换规律，并发现转录因子相互作用存在剂量依赖性协同/拮抗转换，为细胞命运调控提供了高分辨率研究框架。

　　

细胞命运调控是生物医学研究的核心问题，通过转录因子（TF）介导的细胞重编程已成为实现细胞身份转换的重要手段。尽管已有研究发现如“山中因子”（OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC）等关键调控因子可诱导体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），但重编程过程存在显著的异质性和低效率问题。传统研究受限于群体平均化测读技术，难以解析细胞间异质性的来源。近年来研究表明，转录因子剂量变化可能通过影响靶基因组合调控细胞命运，但其在重编程过程中的具体作用机制尚不明确。

为系统解析转录因子剂量对细胞重编程异质性的影响，洛桑联邦理工学院Bart Deplancke团队在《Nature Genetics》发表了题为“Dissecting the impact of transcription factor dose on cell reprogramming heterogeneity using scTF-seq”的研究论文。研究人员开发了单细胞转录因子测序（scTF-seq）技术，通过在单细胞水平诱导条形码化的多西环素（dox）调控转录因子过表达并同步量化转录组变化，构建了小鼠胚胎多能间充质干细胞（MSCs）中384个转录因子的功能获得性图谱。

研究采用阵列式慢病毒包装转导策略，构建了包含419个小鼠转录因子的多西环素诱导型开放阅读框（ORF）文库，每个转录因子携带独特条形码（TF-ID）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和TF-ID富集测序，同步获取单细胞转录组和转录因子表达剂量信息。研究包括对照细胞（mCherry过表达）、功能阳性对照（成脂诱导和Myog过表达细胞）以及九批独立实验，最终获得45,978个高质量细胞数据。

研究发现转录因子按重编程能力（capacity）和剂量敏感性（dose sensitivity）可分为三类：32个高能力-高敏感性转录因子（如HOX、CDX家族），44个高能力-低敏感性转录因子（如POU5F1），以及158个低能力转录因子（如VDR）。高能力转录因子显著富集在功能缺失不耐受基因中，且具有相分离相关特征（如小氨基酸、β转角富集）。通过剂量响应建模，研究揭示了转录因子剂量如何调控谱系特异性分化：CEBPA和PPARG通过剂量依赖性方式激活成脂基因表达，而MYCN虽促进脂滴形成但缺乏晚期成脂标志物Plin4表达，提示其通过独特机制促 adipogenesis。

研究首次发现转录因子剂量可驱动非单调性基因表达响应，导致细胞状态分支。以KLF4为例，低剂量主要调控细胞大小和蛋白复合体组装，中剂量调控细胞内运输，高剂量则调控发育生长和上皮发育。ESR2和MEIS2等转录因子也呈现类似剂量依赖性细胞状态转换规律。同时，研究鉴定到MEIS2和MYOG等转录因子在相似剂量下仍可诱导多状态输出，表明随机性因素在细胞命运决定中发挥重要作用。

细胞周期分析揭示转录因子剂量与细胞周期进程存在复杂交互作用。E2F2过表达促进S期进入但阻滞G2/M期转换，而T和MYCN可同时增加S期和G2/M期细胞比例。成脂分化 requires 细胞周期退出，高剂量CEBPA或PPARG可上调细胞周期抑制剂p21表达，但MYCN可在高剂量下实现增殖与分化并存， albeit 伴随细胞死亡增加。

组合转录因子实验表明，转录因子间存在剂量依赖性相互作用。CEBPA+MYCN组合协同上调成脂基因（Fabp4、Gpd1l），而MYOG+CEBPA则表现拮抗效应。值得注意的是，PPARG+CEBPA组合在低剂量PPARG时成脂能力最强，这与PPARG作为成脂主调控因子的传统认知形成有趣对比。基因特异性分析进一步揭示，CEBPA+MYCN对终末分化标志物（Fabp4、Adipoq）呈现持续协同激活，而对其他成脂相关基因（Pparg、Plin1）则表现剂量依赖性协同/拮抗转换。

该研究开发的scTF-seq技术平台首次实现了转录因子功能、剂量与细胞命运调控的系统性解析，为基因调控研究和细胞工程策略设计提供了高分辨率研究框架。创建的转录因子过表达克隆库和单细胞功能获得性图谱将成为领域重要资源，推动对细胞命运决定机制的深入理解和精准调控。