西欧预烘焙面包霉菌组分离鉴定及优势腐败菌DNA条形码方案构建

本研究针对西欧气调包装预烘焙面包腐败问题，通过DNA条形码技术鉴定出13种优势霉菌物种，其中青霉属（Penicillium）占比高达97%，并首次提出针对腐败菌的多基因联合鉴定方案，为食品保鲜策略优化提供精准靶点。

　　

在现代化食品工业中，预烘焙面包（par-baked bread）因其便捷性而广受欢迎，但其保存过程中易受微生物污染而腐败变质。尽管采用气调包装（Modified Atmosphere Packaging, MAP）通过置换氧气、充入二氧化碳和氮气来抑制微生物生长，仍无法完全避免霉菌污染。传统研究多集中于有限的标准参考霉菌，但实际腐败菌种受产品特性、地理环境和存储条件影响显著，因此精准鉴定特定产品的腐败物种对制定高效防腐策略至关重要。

近期发表于《The Microbe》的研究通过多基因DNA条形码技术，系统性分析了西欧地区气调包装预烘焙面包的霉菌组（mycobiome）构成。研究人员从比利时、芬兰、法国、德国、荷兰和英国收集24个样品，在可控条件下促使样品腐败后分离菌株，结合内部转录间隔区（ITS）、β-微管蛋白基因（BenA）、钙调蛋白基因（CaM）和RNA聚合酶第二亚基（RBP2）测序进行物种鉴定。

关键技术方法包括：样本采集于西欧六国工业生产点，测定水分活度（a_w）和pH值；通过表面划线法从腐败面包分离菌株；采用酚氯仿提取法和FastPrep-24系统进行基因组DNA提取；使用多对引物（如ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b、CMD5/CMD6、RPB2-5F/7CR）PCR扩增目标基因；通过Sanger测序和CLC Workbench进行序列拼接；利用MEGA11构建最大似然法系统发育树进行进化分析。

3.1. 样品采集与特性分析

采集的24个样品a_w值范围为0.88–0.93，pH值为4.6–6.0，低于典型面包产品（通常a_w≥0.96）。不同面包类型或防腐剂与pH/a_w无显著相关性，表明物化参数不是决定腐败菌构成的关键因素。

3.2. 物种多样性分析

从97个分离株中鉴定出13个物种，青霉属（Penicillium）占绝对优势（97%），其中Penicillium palitans（29%）、P. chrysogenum（18%）、P. bialowiezense（11%）和P. crustosum（11%）为最主要物种。曲霉属（Aspergillus）仅检出A. flavus和A. westerdijkiae。与传统研究相比，本研究发现P. roqueforti等常见酸抗性菌未被检出，可能因采样方法聚焦实际致腐菌而非所有污染物。

3.3. DNA条形码成功率

ITS区域作为真菌标准条形码虽能成功扩增并鉴定属级分类单元，但缺乏种间分辨力。β-微管蛋白基因（Bt2a/Bt2b引物）扩增成功率达71%，鉴定成功率达89%，成为最有效的次级标记；钙调蛋白基因（CMD5/CMD6）扩增率高（90%）但鉴定率仅20%，对A. westerdijkiae、P. hordei和P. raistrickii鉴定至关重要；RPB2基因扩增片段约1000bp，鉴定成功率达91%。

3.4. 系统发育分析

ITS系统树分为三大簇：第一簇含P. palitans、P. hordei等菌种（分支短提示高度同源）；第二簇含P. corylophilum、A. flavus等（分支较长）；第三簇含P. raistrickii等。多基因联合分析有效解决了近缘种区分难题。

3.5. 条形码方案提案

研究提出基于ITS初筛、次级标记靶向扩增的鉴定流程：Bt2a/Bt2b适用于多数青霉物种；RPB2对P. brevicompactum等有效；CaM测序对特定物种不可或缺。该方案为未来靶向防腐处理提供了分子鉴定基础。

本研究通过多基因条形码技术揭示了西欧预烘焙面包的优势腐败菌谱系，证实地理特异性菌种构成差异，突破了传统以有限参考霉菌为导向的防腐研究局限。提出的分级鉴定方案不仅提升了物种鉴定准确性，更为开发针对性抗菌策略（如生物防腐剂、包装优化）提供了科学依据。该成果对减少食品浪费、保障食品安全具有重要实践意义，同时为真菌分类学提供了可推广的分子方法学框架。