(E)-2-((E)-辛-2-烯-1-亚基)-肼-1-硫代酰胺通过破坏线粒体能量代谢抑制意大利青霉生长的机制研究

本研究针对柑橘采后蓝霉病防治中化学杀菌剂抗药性严重的问题，开发了一种新型(E)-2-((E)-辛-2-烯-1-亚基)-肼-1-硫代酰胺(EOHC)化合物。研究发现EOHC对意大利青霉(P. italicum)具有显著抑制效果(MIC和MFC均为0.050 g·L-1)，通过破坏细胞膜完整性、诱导线粒体能量代谢紊乱和呼吸代谢障碍发挥抗菌作用。分子对接证实EOHC与SDH和MDH酶直接结合，为开发新型抗真菌剂提供了理论依据。

　　

柑橘作为全球广泛种植的水果作物，不仅风味独特，还具有抗癌、抗氧化等药用价值。然而其采后易受指状青霉和意大利青霉等病原真菌侵染，造成巨大经济损失。目前主要依赖丙氯灵、抑霉唑等化学杀菌剂进行防治，但长期使用导致耐药菌株出现，防治效果下降。开发新型、环保、低毒的抗真菌剂成为采后病害控制研究的重点。

天然活性化合物(E)-2-辛烯醛是从植物精油中提取的天然风味物质，对多种病原真菌表现出有效抑制活性，但其热稳定性差、挥发性高的问题限制了实际应用。通过对其醛基进行结构修饰，研究团队此前开发了一种新型硫代氨基脲衍生物(E)-2-((E)-辛-2-烯-1-亚基)-肼-1-硫代酰胺(EOHC)，该化合物对指状青霉显示出良好的抑制活性，但其对意大利青霉的抗真菌效果及作用机制尚不明确。

发表在《Postharvest Biology and Technology》的这项研究，系统评价了EOHC对意大利青霉的体外和体内抗真菌活性，并深入探讨了其潜在作用机制。研究人员采用琼脂稀释法测定抗菌活性，扫描电镜观察菌丝形态，荧光染色评估细胞壁完整性、膜通透性和ROS水平，试剂盒检测ATP含量、SDH和MDH酶活性，分子对接分析相互作用，并通过柑橘果实实验验证防腐效果。

3.1. EOHC抑制意大利青霉生长

研究表明EOHC在6.25-100 mg·L^-1浓度范围内以浓度依赖性方式抑制意大利青霉生长。培养2天后，50 mg·L^-1浓度下完全无菌丝生长，确定MIC和MFC值均为50 mg·L^-1。

3.2. EOHC有效延缓柑橘果实病害并保持品质

体内实验显示，2×MFC和4×MFC的EOHC处理能不同程度减少蓝霉病发生，且存在浓度依赖现象。贮藏5天后，对照组发病率为100%，而处理组分别为68.3%和54.7%。EOHC处理还能显著减小病斑直径，保持果实硬度、TSS、TA、pH、着色指数和Vc含量等品质指标。

3.3. EOHC引发菌丝表面形态损伤

扫描电镜观察发现，EOHC处理30分钟后导致意大利青霉菌丝表面形态严重破坏。1/2 MIC浓度组出现扭曲和塌陷现象，MIC处理组则表现出更严重的扭曲和皱缩。

3.4. EOHC处理不影响细胞壁完整性

CFW染色结果显示，处理30-120分钟后，菌丝顶端和隔膜的蓝色荧光亮度无变化，荧光强度与对照组无差异，AKP活性也无明显变化，表明EOHC不影响意大利青霉的细胞壁完整性。

3.5. EOHC损伤膜通透性

PI染色结果表明，处理120分钟后，1/2 MIC和MIC处理组的荧光值分别增加到对照组的2.0和2.3倍，表明EOHC能以浓度和时间依赖性方式破坏意大利青霉菌丝细胞膜的完整性。

3.6. EOHC引起ROS积累和膜脂过氧化

DCFH-DA染色显示，EOHC处理引发细胞内ROS积累。处理120分钟后，1/2 MIC和MIC组的荧光比率分别增加到对照组的17.8和31.9倍。H₂O₂含量测定进一步证实了ROS积累。同时，总脂质含量降低，细胞内和细胞外MDA含量显著增加，表明EOHC通过脂质过氧化损伤破坏细胞膜功能。

3.7. EOHC对MMP和ATP含量的影响

JC-10染色显示，EOHC处理导致线粒体膜电位(MMP)降低，红色荧光减弱，绿色荧光增强。处理120分钟后，ATP含量显著降低，表明EOHC破坏意大利青霉细胞的能量代谢。

3.8. EOHC对呼吸代谢的影响

溶解氧测定发现EOHC抑制呼吸代谢，且浓度越高，溶解氧下降趋势越慢。与典型抑制剂(丙二酸、磷酸钠和碘乙酸)的叠加抑制率分别为21.61%、38.35%和47.39%，表明EOHC主要通过抑制TCA循环来抑制意大利青霉的呼吸代谢途径。

3.9. EOHC降低菌丝SDH和MDH酶活性

SDH和MDH活性测定显示，EOHC处理显著降低这两种TCA循环关键酶的活性。处理120分钟后，SDH活性在1/2MIC和MIC组分别降至130.9 g^-1和120.2 g^-1，低于对照组的211.1 g^-1。MDH酶活性也持续低于对照组。

3.10. 分子对接分析

分子对接结果显示，EOHC与SDH的结合能为-4.7 kcal·mol^-1，与His98、Leu92等氨基酸形成疏水相互作用，其-NH₂与SDH的Thr270形成氢键。EOHC与MDH的结合能为-4.2 kcal·mol^-1，与Arg236、Pro254等结合在疏水口袋中，并与Ala169、Ala171和Glu156形成三个氢键。

本研究揭示了EOHC通过破坏线粒体能量代谢抑制意大利青霉生长的多重机制。EOHC不仅直接损伤细胞膜完整性，还引起ROS大量积累和脂质过氧化，导致氧化应激。更重要的是，EOHC通过抑制TCA循环中的关键酶SDH和MDH的活性，破坏线粒体功能，降低ATP生物合成，最终导致能量代谢紊乱。分子对接结果证实了EOHC与这些酶的直接相互作用，为理解其分子机制提供了结构基础。

这些发现不仅阐明了EOHC的抗真菌作用机制，也为开发以线粒体能量代谢为靶点的新型抗真菌剂提供了重要理论依据。EOHC作为一种结构稳定的硫代氨基脲衍生物，具有良好的应用前景，可望成为控制柑橘采后蓝霉病的有效替代方案，减少对传统化学杀菌剂的依赖。