新型小分子化合物NN15-017通过激活MAPK/ERK通路促进人多能干细胞增殖与重编程效率研究

本研究针对人多能干细胞(hPSCs)培养中FGF2依赖性强、成本高的问题，通过化合物筛选发现NN15-017能替代FGF2功能，将培养基中FGF2需求降低5倍，并使人诱导多能干细胞(hiPSCs)重编程效率提升2-3倍。该化合物特异性激活hPSCs中MAPK/ERK通路并影响Hippo-YAP信号，为干细胞临床应用提供了新型化学定义培养方案。

　　

在再生医学领域，人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）展现出巨大的应用潜力。这些细胞不仅为疾病建模和药物筛选提供了宝贵资源，更是细胞治疗和组织再生的重要工具。然而，hPSCs的传统培养方法依赖于动物源性培养基和饲养层细胞，如小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs），这种方法存在异源成分污染风险，不符合临床应用标准。因此，开发化学成分明确（chemically defined）的培养基和无饲养层培养体系成为当务之急。

目前，多种化学成分明确的培养基已被开发，其中E8培养基因其成分简单而被广泛使用。这些培养基通常包含多种生长因子，其中FGF2（成纤维细胞生长因子2）被认为是维持hPSCs未分化状态和促进增殖的关键因子。FGF2通过激活MAPK/ERK通路，可能还涉及PI3K/AKT通路，参与hPSCs的存活、增殖和多能性维持。然而，FGF2的使用成本高昂，且在不同细胞系中的效果存在差异，因此寻找能够替代或减少FGF2用量的化合物具有重要意义。

为了解决这一问题，京都大学的研究团队开展了针对FGF2功能替代化合物的筛选研究。他们使用携带hOCT4-EGFP报告基因的hPSCs系统，通过检测GFP荧光强度来评估化合物的促未分化增殖效果。经过系统筛选，研究人员发现了一种新型小分子化合物NN15-017（2-(diethylamino)ethyl 3-aminobenzoate，CAS # 10369-94-5），并深入研究了其在hPSCs培养和重编程中的应用潜力。

研究采用了多项关键技术方法：基于hOCT4-EGFP报告系统的化合物筛选技术、流式细胞术多能性标志物分析（TRA-1-60、OCT4等）、Western blotting信号通路检测（MAPK/ERK、PI3K/AKT、Hippo-YAP等）、RNA重编程技术（使用ReproRNA-OKSGM Kit从人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HDFs）生成hiPSCs）以及三胚层分化潜能评估（使用STEMdiff Trilineage Medium）。

3.1. NN15-017对hESC培养的影响

研究人员首先评估了NN15-017在短期培养中对hESCs的影响。结果显示，在基础培养基中添加NN15-017能够显著增加OCT4阳性细胞数量，促进未分化hESCs的增殖。浓度梯度实验表明，15μg/ml的NN15-017效果最佳，能够显著提升hESCs的增殖能力（P=0.0057）。

在分子水平上，NN15-017与FGF2类似，能够上调多能性标志物OCT4和NANOG的mRNA表达，但对SOX2表达无影响。值得注意的是，FGF2对分化标志物（GATA3、GATA6、CDH5、PAX6）的表达抑制效果更显著，而NN15-017虽然也呈现抑制趋势，但未达到统计学显著性。这表明NN15-017能有效促进未分化hPSCs的增殖，但不能完全抑制分化。

在长期培养实验中，研究人员发现将NN15-017与低浓度FGF2（20ng/ml）联合使用，能够将FGF2的需求量从100ng/ml降低至20ng/ml，且维持hPSCs未分化状态达15代以上。流式细胞术分析显示，这些细胞高表达多能性标志物，核型分析证实染色体正常，三胚层分化实验证明细胞具有多向分化潜能。

3.2. NN15-017促进人真皮成纤维细胞的重编程效率

研究人员进一步探讨了NN15-017在细胞重编程中的应用价值。使用RNA重编程方法（ReproRNA-OKSGM Kit）将人真皮成纤维细胞重编程为hiPSCs。实验结果显示，在培养中添加15μg/ml的NN15-017能够显著增加TRA-1-60阳性多能性细胞集落数量（P=0.011），表明NN15-017能够提高体细胞重编程效率。

3.3. NN15-017促进MAPK/ERK通路活性

机制研究表明，NN15-017与FGF2类似，能够激活hPSCs中的MAPK/ERK信号通路，促进ERK磷酸化。使用FGF受体抑制剂PD173074和MEK抑制剂PD0325901能够阻断NN15-017诱导的ERK磷酸化，表明NN15-017可能通过FGF受体-MEK-ERK信号级联发挥作用。

有趣的是，在小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1中，FGF2能够激活MAPK/ERK通路，而NN15-017无此效应，提示NN15-017对hPSCs具有选择性激活作用。此外，NN15-017处理降低了YAP磷酸化水平，表明其可能影响Hippo-YAP信号通路，这为理解其作用机制提供了新视角。

研究结论表明，NN15-017作为一种新型小分子化合物，能够部分替代FGF2功能，将hPSCs培养中FGF2的需求量降低5倍，并提高hiPSCs重编程效率2-3倍。其作用机制涉及激活MAPK/ERK信号通路和可能影响Hippo-YAP信号通路。

讨论部分强调，这项研究的发现为hPSCs培养提供了新的策略，减少了对外源性FGF2的依赖，降低了培养成本，提高了重编程效率。NN15-017对hPSCs的特异性作用机制尤为值得关注，其通过激活MAPK/ERK通路但不影响PI3K/AKT通路的特点，为理解hPSCs信号调控网络提供了新见解。然而，研究也存在一定局限性，如NN15-017在其他基础培养基中的效果尚未验证，以及在除HDFs外的其他体细胞中的重编程效果仍需进一步研究。

这项研究发表于《Regenerative Therapy》，为干细胞培养和重编程技术提供了新的化学工具，推动了化学成分明确培养体系的发展，具有重要的理论和应用价值。未来研究应进一步阐明NN15-017的分子作用机制，探索其在更多应用场景中的潜力，为干细胞临床应用的标准化和规模化提供支持。