综述：心血管疾病生物标志物的光电化学生物传感器：进展、挑战与临床前景

本综述推荐一种基于银纳米粒子（AgNPs）和甘露糖-4-氨基苯丙氨酸（Man-4APA）配体的新型电化学免疫传感器，实现了对C反应蛋白（CRP）的高灵敏度检测（线性范围0.5–100 ng/mL，检测限0.38 ng/mL），在胸水样本中成功应用，为心血管疾病（CVD）和炎症的快速诊断提供了新策略。

　　

Introduction

近年来，医学与生命科学的融合突破了传统诊断技术的空间限制。面对全球对高效诊断方法的需求，特别是针对癌症等影响大规模人群的常见疾病，传统侵入性技术（如组织活检）已逐步演进为更实用、便携的解决方案。当前研究致力于开发微创/无创诊断方法，消除手术需求，并克服组织异质性限制。这种探索体内液体中特定分子肿瘤标志物的方法被称为液体活检（LB）。LB通过提供更安全、准确和实时的采样/监测机会，克服了侵入性技术的许多局限。它在循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体等生物标志物的基因组和蛋白质组评估方面提供更全面的数据，指导临床医生确定和监测难以触及的实体组织癌症（如肺、乳腺和胰腺癌）的进展。虽然基于血液的LB已显示可产生肿瘤的分子谱，但最近，发生在肺和胸壁之间的胸水为局部肿瘤微环境提供了一个窗口。当前研究揭示了胸水在诊断某些疾病如结核病、腺癌和心脏病方面的有效性。值得注意的是，在心力衰竭或恶性肿瘤患者中，感染相关肺炎旁积液的诊断延迟导致适当治疗的启动延迟以及并发症发生率的增加。因此，探索具有高灵敏度和选择性的胸膜生物标志物，以快速早期诊断感染和恶性肿瘤，已成为一个活跃的研究领域。最近，各种胸膜生物标志物已被确定用于感染和恶性肿瘤的鉴别诊断。例如，C反应蛋白（CRP）是一种急性期反应物，响应IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF）或白细胞介素-1（IL-1）细胞因子而增加，与心血管疾病甚至自身免疫性疾病相关。文献中的例子揭示了不同的强候选方法，如电化学、光学、压电和光电化学方法，用于检测各种样本类型中的CRP，采用多种原理，如抗原-抗体相互作用、分子印迹聚合物或免疫传感器，重点关注其检测限所指示的灵敏度。其中，电化学方法因其高灵敏度和在复杂生物样品中检测低浓度分析物的能力而受到重视，通常显示出更高的灵敏度。此外，糖配体和电沉积技术的结合已成为进一步提高电化学传感器性能的有前途的策略。特别是，银纳米粒子（AgNPs）已被用于增强各种生物传感器的电化学活性和灵敏度，突出了其符合医疗保健中对经济高效且高效的使用点系统日益增长的需求的成本效益检测系统。

在本研究中，AgNPs在配体甘露糖-4-氨基苯基L-丙氨酸（Man-4APA）存在下合成。在丝网印刷碳电极（SPCEs）上电沉积AgNPs/Man-4APA后，使用EDC-NHS化学通过共价键固定抗CRP。使用AgNPs/P(Man-4APA)/Anti-CRP，实现了CRP的线性范围，计算了LOD，并成功进行了胸水中的CRP检测。

Chemicals

抗C反应蛋白（Anti-CRP）购自Merck（美国）。C反应蛋白（CRP；1.0 mg mL^-1）来自Prospec。L(+)-酒石酸（≥99.5%）购自Fluka。甲醇（MetOH；MW：320.04 g/mol；99.8%）来自Merck。人血清白蛋白（HSA，≥96.0%）、尿素（99.0–100.5%）、间皮素（MSLN）、D-葡萄糖（GLC，≥99.5%）、白细胞介素-6（IL-6，≥98.0%）、人血浆纤维蛋白原（FIB，≥80.0%）、胆红素（BIL，≥98.0%）、铁氰化钾（III）（HCF；K₄[Fe(CN)₆]）、铁氰化钾（II）三水合物（HCF; K₃[Fe(CN)₆]）、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、4-氨基苯基-L-丙氨酸（4APA）、D-甘露糖（Man）、硼氢化钠（NaBH₄）、硝酸银（AgNO₃）、氯化钠（NaCl）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）和所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich（美国），为分析纯级，并按收到状态使用。所有溶液均使用Milli-Q水（18.2 MΩ cm电阻率）制备。

Characterization of Man-4APA

采用两步还原胺化方法（图1A）后，使用FTIR、MS、MS/MS、¹H和¹H COSY NMR方法对合成的Man-4APA进行了表征。Man-4APA的FTIR光谱（图1B）显示了甘露糖的所有特征峰，包括在1614 cm^-1处观察到的酰胺羰基的C=O伸缩振动，而在3285 cm^-1处对应于-OH基团振动的宽峰。此外，在1514 cm^-1处观察到4-氨基苯基L-丙氨酸的NH₂谱带，在1239 cm^-1处观察到C-N伸缩振动。通过质谱（MS）分析进一步证实了Man-4APA的成功合成，显示m/z为381.4 [M+H]⁺，对应于Man-4APA的分子量（380.38 g/mol）。通过MS/MS分析获得的碎片离子进一步验证了结构。此外，通过¹H NMR和¹H COSY NMR分析证实了Man-4APA的化学结构。

Conclusion

成功开发了一种基于AgNPs/P(Man-4APA)/Anti-CRP的电化学免疫传感器，用于临床样品中CRP的灵敏检测。纳米材料上的胺官能团实现了抗CRP的共价结合，增强了生物功能化表面的稳定性和重现性。该传感器的性能与ELISA相当，证明了其在快速准确检测CRP方面的可靠性。这些发现突出了将糖配体与电沉积AgNPs集成以开发用于各种生物标志物检测的高性能生物传感器的有效性。

CRediT authorship contribution statement

Dilek Odaci: 写作 – 审阅和编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。Ecem Saygili: 写作 – 原稿，软件。Tuncay Goksel: 写作 – 审阅和编辑，可视化，监督，项目管理，资金获取。Haydar Soydaner Karaku?;: 写作 – 原稿，可视化。Sultan Sacide Gelen: 写作 – 原稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析，数据管理。

Declaration of Competing Interest

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能影响本报告的工作。

Data availability

未包含主要研究结果、软件或代码，并且未生成或分析新数据。

Acknowledgements

这项工作得到了Ege大学科学研究项目协调单位的支持，项目编号：25271。S.S. Gelen感谢TUBITAK-BIDEB在其博士期间根据2211-A国内博士奖学金计划的范围提供的支持。