采用双标记UHPLC-MS/MS技术精准定量内源性与示踪源性酮体：推动代谢示踪研究新突破

本文开发了一种基于氘代内标（d3-AcAc和[3,4,4,4-d4]βOHB）的双标记UHPLC-MS/MS方法，成功解决了13C标记酮体与内源性酮体同步定量难题。该方法突破了传统方法中同位素内标干扰（如13C4-AcAc）与繁琐前处理（如脱盐步骤）的限制，为代谢示踪（isotope tracing）与代谢通量分析（MFA）研究提供了高精度、高通量的技术平台。

　　

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Reagents and materials

甲醇（MeOH）、水和乙腈（ACN）均为赛默飞世尔科技提供的LC-MS级试剂。乙酸（AA）、氘代硼氢化钠（NaBD₄）、硼氢化钠（NaBH₄）、乙酰乙酸乙酯（ethyl-AcAc）、D-3-羟基丁酸钠（βOHB）、氢氧化钠、盐酸和Dowex粉末（50WX8氢型）均购自西格玛奥德里奇。用于合成[U–¹³C₄]AcAc的乙基-¹³C₄-AcAc、[U–¹³C₄]βOHB和氘代水（D₂O；98%）均采购自剑桥同位素实验室。

Optimization of the purity and yield of AcAc synthesis

大多数代谢酮体的测量主要聚焦于β-羟基丁酸（βOHB），因为乙酰乙酸（AcAc）容易自发脱羧生成丙酮和CO₂。AcAc的脱羧通过酮-烯醇互变异构机制发生，涉及一个环状过渡态，其中羧基质子被转移至β-羰基氧上。在我们先前的工作中，我们评估了实验室自合成AcAc在多种条件下的稳定性。

Advantages and future applications of the developed method

新开发的方法相较于先前描述的酮体定量策略具有若干显著优势。与我们之前开发的方法相比，当前方案通过采用新合成的d₃-AcAc作为稳健的内标，实现了对¹³C标记酮体——特别是[U–¹³C₄]AcAc的定量，并利用[3,4,4,4-d₄]βOHB对[U–¹³C₄]βOHB进行定量。此能力将应用范围从常规定量扩展至更复杂的代谢示踪研究，使得该方法特别适合于基于¹³C示踪剂的稀释法和先进的代谢通量分析（MFA）。

Conclusions

通过评估乙酰乙酸乙酯（ethyl-AcAc）碱催化水解过程中的反应温度和持续时间，并利用¹H NMR监测产物形成，确立了实现AcAc合成（60°C反应3小时）且最大程度消除副产物的最优条件。合成的AcAc不含乙醇或丙酮等干扰副产物，使其适用于体内和体外应用，而不会引起混杂的代谢效应。同时，通过乙酰乙酸乙酯-d₃（ethyl-AcAc-d₃）的碱催化水解优化了d₃-AcAc的合成，并通过¹H NMR验证了其高化学纯度。新开发的UHPLC-MS/MS方法采用d₃-AcAc和[3,4,4,4-d₄]βOHB作为内标，能够同时定量未标记和¹³C标记的AcAc与βOHB，为代谢研究提供了强大工具。