人晶状体上皮细胞晶状体蛋白空间定量分析揭示手术应激下CRYAB特异性边缘积累机制

本研究针对天然人类上皮组织中空间蛋白动态解析的技术难题，开发了一套集成三维共聚焦成像、计算组织扁平化与数字分割的图像处理流程，并以人晶状体前囊上皮复合体为模型，实现对αB-晶状体蛋白（CRYAB）与βB2-晶状体蛋白（CRYBB2）的高分辨率定量定位分析。研究发现，白内障手术中无论激光或手动囊膜切开均诱发CRYAB在切口边缘上皮细胞中显著积累，提示其作为急性应激响应蛋白的角色，而CRYBB2分布未受影响。该平台为原位定量解析天然上皮结构中蛋白定位提供了可扩展框架。

　　

眼睛作为人体中可直接观察的器官，为研究系统性与眼部健康提供了独特窗口，其晶状体更因形态简单和易于获取而成为上皮发育、功能、衰老与疾病研究的理想模型。晶状体前半球覆盖着单层高度极化的晶状体上皮细胞（LECs），这些细胞不仅负责维持晶状体稳态，更在氧化应激、炎症、药物及老龄化等因素影响下可能发生功能障碍，进而引发白内障——全球首要致盲疾病。白内障手术中，尽管晶状体纤维已被移除，残留的LECs仍可能参与异常伤口愈合或上皮-间质转化过程，导致后囊混浊（PCO）等并发症。近年来，比较传统超声乳化与飞秒激光辅助白内障手术（FLACS）对LECs应激激活的影响已成为研究热点。

在这一背景下，晶状体蛋白尤其是αB-晶状体蛋白（CRYAB）作为小热休克蛋白家族成员，在应激状态下可防止蛋白聚集，并参与抗炎与神经保护过程，逐渐成为应激响应的关键生物标志物与潜在治疗靶点。而βB2-晶状体蛋白（CRYBB2）传统上被视为结构蛋白，但新证据表明其可能也参与应激响应。然而，由于天然上皮组织常呈曲面或不规则安装，解析其空间蛋白动态一直存在技术挑战。

为此，研究人员在《Scientific Reports》上发表论文，开发了一套计算成像流程，整合全标本免疫染色、3D共聚焦成像、计算组织扁平化、数字分割与空间回归技术，实现对蛋白亚细胞分布的组织尺度定量图谱绘制。以人前囊晶状体细胞（ALCCs）为原理验证平台，研究团队在白内障手术中获取样本，聚焦CRYAB与CRYBB2，探究其在手术应激下的空间与亚细胞分布模式。

研究主要关键技术方法包括：利用全标本免疫染色处理手术中获取的ALCCs样本；通过3D共聚焦显微镜获取多通道图像栈；采用焦点校正与插值算法生成全视野清晰图像；应用标记控制分水岭算法实现细胞质与核质的自动分割；基于距离的空间信号分析以及像素与分区水平的共定位量化技术。样本来源为白内障手术中获得的25例前囊晶状体细胞样本（20例手动超声乳化，5例飞秒激光辅助）。

研究结果部分通过以下发现展开：

实施数字图像处理流程实现ALCC中蛋白分布的3D共聚焦分析

通过焦点校正与分区分割，团队成功将原始共聚焦图像栈转化为高分辨率二维图像，并分离每个细胞的细胞质与核质区域，实现CRYAB与CRYBB2荧光强度的分区特异性量化，为后续相关性分析奠定基础。

囊膜切开术诱导CRYAB特异性在LEC边缘早期积累，而CRYBB2无此现象

对25个样本的分析显示，CRYAB信号在囊膜切开边缘附近（5-30μm）显著峰值，随距离增加而递减，其近端区间分数（IF_CRYAB）平均值为0.621，显著高于均匀分布值0.5（p=0.002）。相反，CRYBB2分布均匀或略呈远端升高，IF_CRYBB2平均为0.353，显著低于0.5（p=0.001）。两者IF差异极显著（p<0.0005），表明CRYAB在白内障手术创伤下呈现快速、局部化的应激响应积累。

像素级共定位分析检测LEC上皮中CRYAB与CRYBB2的空间相关性

尽管CRYBB2未显示边缘重分布，像素级分析发现CRYAB与CRYBB2间存在显著正相关（PCC=0.54±0.14; SRCC=0.67±0.11）。Costes方法进一步确认细胞质内高置信共定位区域（PCC_Costes=0.41±0.19），Manders系数（M1=0.81±0.16; M2=0.75±0.18）表明高度共定位，但较低M2值提示CRYBB2存在独立存在情况。细胞质掩模分析验证了两者在LEC细胞质内的真实空间相关性。

分区定量分析揭示CRYAB与CRYBB2主要胞质分布及CRYBB2罕见核积累

分区分析显示，CRYAB与CRYBB2在细胞质与核质内均存在，且细胞内强度高度相关（细胞质PCC=0.57±0.19; 核质PCC=0.65±0.16）。CRYBB2核分数（0.263±0.094）高于CRYAB（0.206±0.085），且部分细胞呈现CRYBB2独家核积累，而CRYAB阳性细胞均表达CRYBB2，反之不成立。细胞质CRYAB与核CRYBB2显著相关（PCC=0.65±0.15），表明两者分布存在协调性。

囊膜切开类型不影响切割边缘CRYAB/CRYBB2积累 despite 差异细胞损失

比较手动与FLACS样本，发现FLACS造成更大上皮损失区（中位数面积17041.0 px2 vs. CCC 2123.4 px2, p<0.001），但两种手术方式下CRYAB与CRYBB2的近端积累无显著差异，表明蛋白响应可能快速饱和，不受手术方法影响。

研究结论与讨论强调，该集成方法实现了天然上皮架构中蛋白定位的高分辨率定量解析，成功以CRYAB与CRYBB2为例揭示手术应激下空间特异性响应模式。CRYAB在切口边缘的快速积累支持其作为急性应激 chaperone 的功能，而CRYBB2的稳定分布与偶尔核积累提示其可能超越结构角色，参与核内调控。平台可扩展至其他蛋白标记与组织类型，为研究上皮损伤、再生与可塑性提供强大工具。未来研究可整合时序蛋白与转录组分析，进一步揭示从急性损伤到长期重塑的机制转变。