数字PCR技术开发中黄6106转基因大豆基因组DNA标准物质及其在食品饲料检测中的应用研究

本研究针对转基因大豆中黄6106定量检测缺乏核酸标准物质的瓶颈，开发了基于基因组DNA(gDNA)的认证标准物质(CRM)。通过提取纯合转基因中黄6106与非转基因中黄10叶片gDNA按比例混合，经8家实验室联合验证，采用数字PCR(dPCR)技术确定外源基因序列拷贝数浓度为(1.04±0.16)×103 copies·μL-1，中黄6106与Lectin基因拷贝数比为0.047±0.006。该标准物质在37℃可稳定保存10天，-20℃可稳定保存6个月，为转基因大豆及其产品的定性与定量检测提供了可靠计量标准。

　　

转基因大豆已成为全球种植面积最大的转基因作物，占全球转基因作物总面积的48.9%，占全球大豆种植面积的73.7%。随着转基因大豆作为食品加工原料的广泛应用，其安全性备受关注，多国实施了转基因成分定量标识制度。准确测定食品中转基因作物含量需要标准参考物质支撑，而基因组DNA标准物质因其易于大规模制备、均匀性好、定量准确等优势，成为转基因产品检测的重要基础。

目前国际上基因组DNA标准物质主要由美国油化学家协会(AOCS)供应，欧盟联合研究中心(JRC)也开发了多种转基因事件的标准物质。然而，对于我国自主研发的除草剂耐受型转基因大豆中黄6106（含有GAT和G2-EPSPS基因），虽已建立定性检测标准，但核酸标准物质的研发尚属空白。这制约了该品种定量检测的准确性和可靠性，也影响了相关检测方法的标准化和实验室质量控制。

为解决这一问题，天津市农业科学院的研究团队开展了中黄6106转基因大豆基因组DNA标准物质的研制工作。该研究通过从纯合转基因中黄6106和非转基因受体中黄10叶片中提取高质量基因组DNA，按比例混合制备标准物质，并采用新兴的数字PCR(digital PCR, dPCR)技术进行绝对定量，最终开发出我国首例中黄6106基因组DNA认证标准物质(CRM)，为转基因大豆的食品安全监管和成分检测提供了科学有效的技术支撑。该研究成果发表于《Scientific Reports》期刊。

研究采用的主要技术方法包括：从300株中黄6106大豆V3期叶片中提取高质量基因组DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法评估DNA完整性和纯度；设计特异性引物和探针，采用微滴式数字PCR系统(Bio-Rad QX100)进行绝对定量分析；通过八家权威实验室联合验证，采用统计方法（Dixon检验、Grubbs检验、Cochran检验和D'Agostino-Pearson正态性检验）评估数据可靠性；按照ISO Guide 35:2017标准进行均匀性和稳定性评估。

结果

gDNA评估结果

将合格gDNA用0.1×TE溶液稀释至25 ng·μL^-1浓度，按1:20比例混合中黄6106与非转基因中黄10 gDNA。从混合管上、中、下部位取样检测，dPCR结果显示不同位置样品的拷贝数浓度和拷贝数比无显著差异。Sanger测序证实中黄6106特异性序列与MON89788大豆、3272玉米、MON88302油菜和T1c-19水稻等转基因作物的启动子区域存在部分同源性，但诊断引物设计在该区域之外，确保检测特异性。实时PCR特异性试验显示，这些高同源性转化体样品均无 detectable扩增，dPCR系统中仅中黄6106 gDNA产生阳性微滴，证实检测系统具有优异特异性。

均匀性评估结果

对45个随机选取的中黄6106 gDNA样品进行dPCR分析，基于外源基因和内标基因拷贝数计算中黄6106与Lectin的拷贝数比。单因素方差分析显示F<>_0.05(14,30)，表明分装后gDNA溶液管间均匀性无显著差异。拷贝数比的均匀性不确定度u_bb=0.00018，相对不确定度u_rel(bb)=0.0036；拷贝数浓度的均匀性不确定度u_bb=16.00，相对不确定度u_rel(bb)=0.016，表明该gDNA CRM具有优异的均匀性。

稳定性评估结果

短期稳定性：在-20°C、4°C、25°C和37°C条件下储存10天后，中黄6106与Lectin的拷贝数比均保持在可接受范围内，斜率不显著（|β₁|<>_0.95,n-2·s(β₁)）。以25°C条件计算短期稳定性不确定度，拷贝数比u_s(sts)=0.001，相对不确定度u_rel(sts)=0.022；拷贝数浓度u_s(sts)=53.5，相对不确定度u_rel(sts)=0.049。表明gDNA CRM在高达37°C温度下可稳定储存和运输10天。

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长期稳定性：在-20°C储存0、1、2、4和6个月后，中黄6106与Lectin的拷贝数比保持稳定，斜率不显著。拷贝数比u_s(lts)=2.26×10^-4，相对不确定度u_rel(lts)=0.0045；拷贝数浓度u_s(lts)=13.62，相对不确定度u_rel(lts)=0.013。表明gDNA CRM在-20°C下可稳定保存至少6个月。

实验室联合验证结果

八家实验室联合校准的原始数据经Dixon和Grubbs检验均处于正常范围，D'Agostino-Pearson正态性检验表明数据呈正态分布。Cochran检验统计量C=0.2442小于临界值C_(0.05,8,16)=0.2462，确认8组数据具有同等准确性。合成标准不确定度计算显示，外源基因序列拷贝数浓度的定值结果为(1.04±0.16)×10³ copies·μL^-1，中黄6106与Lectin拷贝数比的定值结果为0.047±0.006。

讨论与结论

本研究首次开发了转基因大豆中黄6106的基因组DNA认证标准物质，采用数字PCR技术进行绝对定量，确定了外源基因序列拷贝数浓度和中黄6106与内标基因Lectin的拷贝数比两个关键定量参数。与传统的实时荧光定量PCR(qPCR)相比，dPCR具有更高的灵敏度和对抑制剂的耐受性，特别适用于经过烘烤、油炸和微波等加工处理的食品样品检测，结果更加稳健准确。

该标准物质表现出优异的均匀性和稳定性，在37°C下可稳定保存10天，满足运输过程中的温度波动要求；在-20°C下可稳定保存6个月，满足日常储存需求。八家实验室联合验证证实了定值结果的准确性和可靠性，为转基因大豆中黄6106及其相关产品的定性定量检测提供了计量标准，也可用于特异性检测方法的评价和实验室质量控制。

虽然中黄6106尚未开始商业化种植，但本研究填补了该品种核酸标准物质的国际空白，推动了我国转基因大豆与国际标准接轨，促进了全球检测协议的协调统一。研究人员表示，下一步将开发覆盖更宽浓度范围的一系列重量法认证标准，建立完整的中黄6106基因组DNA标准物质体系，为食品和饲料基质中该转基因大豆的检测提供 robust分析框架。本研究建立的方法学框架可直接转移到任何基因组完全表征的转基因作物，避免重复的方法开发工作，为转基因作物的商业化释放提供技术支持，最大限度地减少环境足迹。