Neope bremeri（蛱蝶科：眼蝶亚科）线粒体全基因组揭示眼蝶族系统发育新见解

本研究首次完成Neope bremeri（眼蝶亚科）线粒体基因组（mitogenome）的测序与注释，揭示其15,216 bp环状结构包含13个PCGs、22个tRNAs和2个rRNAs，通过AT/GC偏斜分析（AT skew=-0.039；GC skew=-0.252）及系统发育重建，为蛱蝶科进化研究提供关键分子基础。

　　

引言

蛱蝶科（Nymphalidae）作为鳞翅目中物种最丰富的类群，全球已知约7,200种，广泛分布于各类生态环境中。眼蝶亚科（Satyrinae）作为该科中进化历史较晚的分支，其亚洲特有属Neope尤其值得关注。目前NCBI数据库收录该属9个物种，多数为中国特有种。昆虫线粒体DNA因结构简单、进化速率快等特点，已成为系统学研究的重要分子标记。典型蝴蝶线粒体基因组为14-16 kb的环状分子，包含一个控制区及37个基因（13个蛋白编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因）。迄今已有四种Neope属物种的线粒体基因组公开发表，而主要分布于中国台湾、广东、浙江等地的Neope bremeri其线粒体基因组尚未被报道。

材料与方法

样本采集与DNA提取

本研究于2024年7月在安徽省芜湖市弋江区（31.17°N, 118.21°E）采集Neope bremeri标本（凭证号GMX_001）。通过背腹翅脉形态特征（基部对称系统具四个眼斑状结构，中央对称系统形成纵向延伸带）进行物种鉴定。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）从标本腿部提取基因组DNA，保存于-20°C备用。

测序与组装

采用Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序，经Fastp v0.23.4质控后获得23,237,956条高质量读段（清洁数据率98.88%）。通过Bowtie2 v2.2.4将读段映射至近缘物种参考序列，利用SPAdes v3.15.5进行contig组装，SSPACE v2.0完成scaffold连接。最终组装结果经读段回比验证显示均匀覆盖度（图S1）。

注释与分析

使用Mitos2进行初步注释（E-value Exponent=5, Maximum Overlap=100），并通过Geneious Prime 2025.0参照近缘种Neope pulaha（KF590543）进行人工校正。采用Proksee服务器绘制基因组图谱，通过Phylosuite v1.2.3集成Biopython包进行碱基组成分析。

系统发育分析

选取4种Neope属物种及11个近缘属（Mycalesis、Lopinga、Tatinga、Lethe、Chonala）的线粒体基因组，以Melitaea ambigua（Nymphalinae亚科，MK252271）和Neptis thisbe（Limenitidinae亚科，OK393687）作为外群。使用Phylosuite提取13个PCGs和2个rRNAs序列，经MAFFT v7.313比对后，通过MACSE v2.03优化密码子对齐。采用ModelFinder v2.2.0（BIC准则）和PartitionFinder2 v2.1.1（AIC准则）确定最佳分区策略（表S1-S2）。分别使用IQ-TREE v1.6.8（5,000次超快速自举重复）构建最大似然（ML）树，以及MrBayes 3.2.6（1,000万代运行，25%老化率）构建贝叶斯推断（BI）树，最终通过ITOL v7.2可视化。

结果

基因组特征

Neope bremeri线粒体基因组为15,216 bp环状分子，包含37个基因（13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs）及一个控制区。其中14个tRNA基因和9个PCGs位于主要链（J-strand），其余基因位于次要链（N-strand）。全基因组碱基组成为A（38.17%）、T（41.23%）、C（12.89%）、G（7.71%），呈现负AT偏斜（-0.039）和负GC偏斜（-0.252）。

蛋白编码基因

13个PCGs总长11,198 bp，A+T含量77.64%。起始密码子以ATA、ATG、ATT为主，唯cox1基因使用CGA作为起始密码子。8个基因以TAA为终止密码子，其余使用T碱基终止。PCGs的AT偏斜为-0.039，GC偏斜为0.002。

RNA基因

rrnL（1,336 bp）和rrnS（785 bp）的A+T含量分别为84.58%和86.5%。22个tRNA总长1,445 bp，A+T含量80.14%，AT偏斜（0.026）和GC偏斜（0.143）均为正值。

系统发育

基于13个PCGs和2个rRNAs构建的ML与BI树拓扑结构高度一致（自举支持率≥93%，后验概率≥0.999）。所有Neope物种聚为一支，其中N. bremeri与N. goschkevischii亲缘关系最近。系统发育显示Neope与（Lopinga+Tatinga+Lethe+Chonala）构成姐妹群。

讨论与结论

本研究首次完成N. bremeri线粒体基因组测序，其基因排列与蛱蝶科其他物种一致。cox1基因使用CGA起始密码子符合鳞翅目昆虫典型特征。系统发育结果与Yang等（2020）研究一致，但不同于Wu等（2022）提出的Neope与Ninguta聚类的结论，这种差异可能源于分类单元取样或建树方法的不同。该基因组的发布为蛱蝶科系统发育、物种鉴定及生物地理学研究提供了重要分子基础。

伦理声明

样本采集地不属于保护区范围，无需伦理审批。

作者贡献

Qian Gu：形式分析，调查，验证；Yu Zhu：数据管理，验证；Jiusheng Wang：形式分析，验证；Mengen Chen：调查，可视化；Ting Huang：概念化，可视化，文稿撰写与修订；Mingxia Ge：概念化，监督，文稿撰写与修订。

数据可用性

基因组序列数据保存于NCBI GenBank（登录号PQ876913），关联项目编号为PRJNA1235870，SRA编号SRR32693165，生物样本编号SAMN47369391。