FASN通过调控NRF2表达与核转位介导CSE诱导的II型肺泡上皮细胞凋亡、氧化应激及线粒体损伤的机制研究

本研究深入探讨了香烟烟雾提取物（CSE）通过抑制脂肪酸合酶（FASN）表达及其与核因子E2相关因子2（NRF2）的相互作用，进而损害NRF2介导的抗氧化反应，导致线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能障碍、结构损伤并最终诱发细胞凋亡的分子机制。该发现揭示了FASN作为吸烟相关肺损伤潜在治疗靶点的重要价值。

　　

CSE causes mitochondrial damage and apoptosis in AEC2

研究通过CCK-8检测发现CSE以浓度依赖性方式抑制RLE-6TN细胞增殖。DCFH-DA荧光染色显示CSE处理显著增加细胞内活性氧（ROS）水平，而抗氧化剂mito-TEMPO可部分缓解此效应。JC-1染色表明CSE引起线粒体膜电位（MMP）显著降低，提示线粒体膜通透性增加。Western blot分析显示CSE处理后OXPHOS复合物亚基NDUFB8、UQCRC2和MTCO2表达显著降低，而SDHB和ATP5A变化不明显。透射电镜（TEM）观察发现CSE导致线粒体肿胀、嵴面积和体积减少。凋亡相关蛋白检测显示BAX/BCL2比值随CSE浓度增加而升高，Cleaved Caspase-3表达上调，流式细胞术证实凋亡率显著增加。

CSE causes oxidative stress and NRF2 activation in RLE-6TN

Western blot和qPCR分析表明CSE刺激后总NRF2蛋白水平先升高后降低，而核NRF2蛋白在24小时内持续增加。NRF2下游靶基因HO-1和NQO-1的mRNA表达呈现相似趋势。免疫荧光显示NRF2核转位在CSE干预后明显增强，但48小时后显著下降，伴随ROS水平持续升高，表明细胞抗氧化系统逐渐耗竭。

Effects of NRF2 gene knockout on oxidative stress, apoptosis, mitochondrial function, and structure with or without CSE intervention

NRF2敲除后，Western blot验证敲除效率并显示下游HO-1和NQO-1表达降低。DCFH-DA检测发现siNrf2细胞基础ROS水平升高，CSE处理后ROS增加幅度较对照组减小。JC-1染色显示NRF2缺失加剧MMP失衡，但CSE引起的MMP降低程度减轻。凋亡蛋白检测显示siNrf2细胞中CSE诱导的BAX上调和BCL2下调程度减弱。流式细胞术表明NRF2敲除加剧基础凋亡，但CSE处理的凋亡增加幅度降低。OXPHOS复合物蛋白在siNrf2细胞中表达进一步下降，但CSE引起的降低程度减轻。TEM显示NRF2缺失导致线粒体结构严重破坏，但CSE处理后的损伤程度较野生型细胞减轻。

The interaction between NRF2 and FASN in RLE-6TN is abrogated upon CSE stimulation

免疫沉淀联合质谱（IP-MS）鉴定出1387个NRF2互作蛋白，通过与线粒体基因集MitoCarta 3.0交叉筛选获得FASN。分子对接显示FASN与NRF2结合亲和力得分-238.00，置信度0.8532。Co-IP实验证实NRF2与FASN直接结合，且CSE处理显著降低两者结合强度。Western blot和免疫荧光显示FASN表达随CSE浓度和时间增加而逐渐降低。

CSE affects oxidative stress, NRF2 expression, and nuclear translocation by inhibiting FASN

FASN敲除后，Western blot显示总NRF2和核NRF2蛋白表达降低，下游HO-1和NQO-1表达下降。免疫荧光证实NRF2核转位受阻。Manders共定位系数分析显示对照组NRF2与FASN广泛共定位（M1值高），而CSE处理、siFasn单独或联合干预显著降低共定位程度。ROS检测发现FASN缺失加剧基础ROS水平，但CSE引起的ROS增加幅度较对照组减小。

Effects of FASN gene knockout on apoptosis, mitochondrial function, and structure with or without CSE intervention

Western blot显示siFasn细胞中CSE诱导的BAX上调和BCL2下调程度减轻，Cleaved Caspase-3增加幅度降低。流式细胞术表明FASN敲除加剧基础凋亡，但CSE处理的凋亡率增加较对照组减轻。OXPHOS复合物蛋白在siFasn细胞中表达降低，但CSE引起的蛋白减少程度减轻。TEM观察发现FASN缺失导致线粒体结构损伤，但CSE处理后的超微结构异常较野生型细胞缓解。

Discussion

研究证实CSE通过降低FASN表达及其与NRF2的结合能力，抑制NRF2核转位和抗氧化基因转录，导致ROS累积和线粒体OXPHOS功能障碍，最终诱发细胞凋亡。FASN作为脂代谢关键酶，在维持肺泡上皮细胞稳态中发挥重要作用，其表达下调在COPD和IPF患者中得到验证。本研究揭示了FASN-NRF2轴在CSE诱导的肺上皮细胞损伤中的核心调控作用，为吸烟相关肺疾病提供了潜在治疗靶点。研究局限性包括仅使用细胞系模型，未来需通过转基因动物实验进一步验证。