双CRISPRi-seq技术揭示肺炎链球菌细胞周期中基因互作网络

研究人员开发了双CRISPRi-seq方法，解决了细菌基因功能冗余导致的表型缺失难题。通过在全基因组范围筛选肺炎链球菌的基因间相互作用，鉴定出4,026个遗传互作关系，揭示了细胞分裂、染色体分离等关键过程的调控网络，为病原菌生物学研究提供了新范式。

　　

在微生物学研究领域，理解基因型与表型之间的关系始终是一个核心挑战。许多细菌基因在实验室条件下不显示明显表型，这种"基因冗余"现象使得功能研究陷入困境。以人类病原体肺炎链球菌为例，研究表明约75%的基因在常规条件下是非必需的，这意味着大量基因功能被隐藏在了复杂的遗传互作网络中。

传统方法如转座子测序(Tn-seq)和合成遗传阵列(SGA)虽然取得了一定进展，但存在明显局限性：它们难以研究必需基因，适用范围有限，且无法实现全基因组规模的互作分析。特别是在肺炎链球菌这类椭圆形革兰氏阳性菌中，细胞分裂和伸长是两个独立但需要精确协调的过程，其背后的遗传调控网络一直缺乏系统性的解析。

为了解决这些难题，Julien Dénéréaz等研究人员在《Cell Systems》上发表了创新性研究成果。他们开发了一种名为双CRISPRi-seq(dual CRISPRi-seq)的全基因组遗传互作筛选方法，并在肺炎链球菌中成功应用，绘制了迄今为止最全面的细菌遗传互作网络图谱。

研究人员采用了几项关键技术：首先构建了包含869个sgRNA的文库，覆盖了70%的肺炎链球菌基因组元件；然后通过两步克隆策略创建了378,015个独特的双sgRNA组合；利用诱导型dCas9系统实现基因表达的精准调控；最后通过高通量测序和生物信息学分析定量评估每个基因组合的适合度效应。

研究结果揭示了4,026个显著的遗传相互作用，包括1,935个负向互作和2,091个正向互作。这些互作关系通过专门的在线平台PneumoGIN（肺炎球菌遗传互作网络）向科学社区开放，为后续研究提供了宝贵资源。

SMC与染色体分离基因的相互作用

研究发现结构维持染色体蛋白SMC与scpA、scpB形成三元复合物，类似于其他细菌中的凝聚素复合物。通过遗传互作分析，发现了hlpA（编码组蛋白样蛋白HlpA/HU）和ftsK（保守的ATP依赖性DNA转运酶）与SMC复合物成员之间存在强烈的负向相互作用。这些发现通过smc缺失突变体中的CRISPRi实验得到验证，证明这些基因在染色体组织中的协同作用。

DivIB和DivIC在细胞伸长中的核心作用

研究揭示了DivIB和DivIC在协调细胞分裂和伸长过程中的关键角色。这两个蛋白与FtsL形成晚期分裂复合体，负向调控细胞伸长机器组分如rodA、mreC、mreD、pbp2b和mpgA。特别值得注意的是divIB与mpgA（muramidase）之间的负向互作，通过双缺失实验和显微镜观察证实同时缺失这两个基因导致细胞形态异常。

未知基因的功能预测

通过遗传互作网络的相关性分析，研究预测了多个未知基因的功能。例如，spv_1662与细胞分裂基因divIB和divIC高度相关，提示其参与细胞分裂过程；而spv_0761与hlpA和pcrA的极端负向互作表明其在染色体分离中的重要作用。

代谢途径中的遗传互作

研究还发现了scrA（蔗糖磷酸转移酶转运蛋白）和scrB（蔗糖-6-P水解酶）之间的正向相互作用。实验证明scrB的单独敲低导致生长缺陷，但这种缺陷在双敲低 strain 中被挽救，表明蔗糖-6-P的细胞内积累具有毒性效应。

这项研究的结论部分强调了双CRISPRi-seq方法的广泛适用性和重要性。研究人员成功建立了第一个全基因组规模的细菌遗传互作网络，不仅验证了已知的生物学通路，还发现了大量新的遗传关系。这些发现对理解细菌细胞周期的精细调控提供了全新视角，特别是在细胞分裂、染色体分离和细胞形态维持等核心过程方面。

研究的讨论部分指出，这种方法能够揭示必需基因之间的相互作用，这是传统方法难以实现的。同时，遗传互作网络的高相关性使得功能未知基因的预测成为可能，为后续功能研究提供了重要线索。研究人员还强调了该方法在抗菌药物开发中的潜在应用价值，通过识别合成致死基因对，为联合疗法设计提供了新思路。

这项技术平台的建立为在其他微生物中开展类似研究提供了路线图，而肺炎球菌遗传互作网络的解析则为理解病原菌生物学和开发新型抗菌策略奠定了坚实基础。随着更多条件特异性筛选的开展，这一方法有望揭示环境依赖的遗传互作，为针对特定感染环境的治疗策略提供指导。