不列颠哥伦比亚省室外大麻根冠腐病复合病原菌（镰刀菌与腐霉）的鉴定与致病性研究

本文首次系统报道了加拿大不列颠哥伦比亚省半干旱地区室外栽培大麻（Cannabis sativa L.）的根冠腐病病原复合体，鉴定出Globisporangium sylvaticum、Fusarium commune、F. sporotrichioides和F. acuminatum四种新病原，并证实其与啤酒花潜隐类病毒（HLVd）的协同侵染机制。通过分子鉴定（ITS/EF-1α测序）和病原性实验（水培/扦插接种模型），揭示G. sylvaticum和F. commune的强致病性及复合侵染加重根腐症状，为户外大麻病害防控提供关键病原学依据。

　　

Abstract

不列颠哥伦比亚省中部南部室外栽培的高四氢大麻酚（THC）含量大麻植株在2023年4月至8月期间出现生长迟缓、黄化和卷叶症状。通过对三种基因型的根和冠部组织进行表面消毒并接种于含130 mg L^?1硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，结合形态学标准和核糖体DNA ITS1-ITS4区的PCR鉴定，从患病组织中分离出的菌属及种属按频率递减顺序为Globisporangium sylvaticum、Fusarium commune、F. equiseti、F. sporotrichioides和F. acuminatum。在基因型‘Grandaddy Bruce’的叶片组织中检测到啤酒花潜隐类病毒（HLVd）。通过真菌和卵菌分离物的菌丝和孢子混合物接种大麻基因型‘Powdered Donuts’的茎插条、生根插条和水培植株，3-4周后评估发病率和严重度。所有实验中，G. sylvaticum和F. commune的致病性最强，其次是F. acuminatum和F. sporotrichioides，而F. equiseti接种后病害发展极微。F. commune、G. sylvaticum、F. acuminatum和F. sporotrichioides均引起矮化、根褐变和腐烂症状，这些种属均为加拿大境内首次报道的大麻根病原体。G. sylvaticum与F. commune的复合接种比单一病原接种导致更严重的根症状。

Introduction

2018年加拿大法律允许许可生产者种植含精神活性化合物（-）-反式-Δ9-四氢大麻酚（THC）及其他大麻素和萜烯的大麻植株（ marijuana），生产区域包括室内种植室、温室（多为玻璃覆盖）和室外田间场地。最新统计显示温室栽培面积达130万平方米（约1370万平方英尺），涉及472家生产者，而室外生产覆盖580公顷，涉及91家生产者。室外种植因成本较低而逐步增加。尽管对温室栽培大麻的病原体已有广泛研究，但室外种植大麻的潜在病原体信息匮乏。相比之下，加拿大和美国对室外种植hemp（THC含量<0.3%的C. sativa）的病原体有深入认知。

2023年春季，位于不列颠哥伦比亚省中部南部半干旱环境（夏季炎热干燥，年降水量约35厘米）的一处室外大麻生产基地出现幼株生长迟缓、叶片黄化和卷叶症状，8月开花期植株出现矮化和黄化。为确定病因，对 symptomatic plants进行了一系列实验以鉴定相关病原体。结果揭示了四种加拿大未报道的大麻根病原体：F. commune、G. sylvaticum、F. acuminatum和F. sporotrichioides，同时报道了啤酒花潜隐类病毒（HLVd）感染一种基因型的室外栽培大麻。

Materials and methods

Field site and sampling

研究场地如Fig. 1所示，多种基因型采用定制行距栽培（Fig. 1a–c），每株提供独立滴灌，植株上方覆盖网罩以支撑花序直立生长（Fig. 1a,c）。8月部分基因型的花序接近收获期（Fig. 1d,e），其他计划9月收获。早春（3月底）从温室移植到田间的约100-150株植株出现生长迟缓、叶片黄化和卷叶症状（Fig. 2）。采集根区和土壤样本，实验室中将根段表面消毒（10%漂白溶液30秒，70%乙醇30秒，无菌水冲洗三次）后接种于PDA+S培养基，每样本三重复培养皿，培养5-10天。转移 resembling Fusarium或Pythium的菌落进行形态鉴定（菌落颜色、大小和孢子形态）。土壤样本稀释至10^?3，取0.5 mL涂布于PDA+S，5天后 sub-cultured并与根部分离物比较。

8月同一田块开花植株出现黄化和矮化症状（Fig. 3和4），基因型包括‘Red Dragon’、‘Grandaddy Bruce’和‘Star Killer’。按前述方法采集根、冠部和土壤样本，另取显示卷叶和明显矮化的叶和叶柄样本检测病毒和类病毒。

Molecular identification

将4株Pythium和6株Fusarium培养物送交圭尔夫大学实验室服务部（ Agriculture and Food Laboratory）通过引物ITS1–ITS4（ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA和ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC）和延伸因子1α（EF-1α）引物组（EF-1 5??ATGGGTAAGGAGGACAAGAC 3??和EF-2 5??GGAGGTACCAGTGATCATGTT 3??）进行PCR物种鉴定。序列与NCBI GenBank数据库比对，使用CLUSTALW程序进行多序列比对，MEGA v.11软件采用最大似然法（ML）和最大简约法（MP）进行系统发育分析，bootstrap检验1000次重复。

叶样本检测甜菜曲顶病毒（BCTV）和HLVd，采用Punja, Kahl, et al. (2024)方法，对12份样本进行PCR检测。

Colony growth and inoculum production

Fig. 5显示通过EF-1α和ITS1-ITS4序列鉴定的4种Fusarium spp.和1种Globisporangium的独特菌落形态。为测定温度对菌落生长的影响，将0.5 cm菌块转接PDA+S，三重复培养皿置于20°C或30°C培养箱，每2-3天测量菌落直径至9天，实验重复两次。为制备接种物，所有分离物在125 mL马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中125 rpm摇培7天（21–23°C，12–14小时荧光照明），后与125 mL无菌水混合搅拌30秒，菌丝+孢子 slurry用于接种。

Pathogenicity experiments

Stem cutting inoculations

从许可设施取长约20 cm茎插条，修剪至12–15 cm高并剪叶减少蒸腾，插入预湿岩棉块（2.5 cm²），6插条一组置于Tupperware容器（12 cm×8 cm×6 cm）。每插条基部加2 mL接种物，容器覆盖塑料罩实验室条件下培养28天，对照加2 mL无菌水。每7天按0–4级评估：0=健康；1=萎蔫或轻微黄化；2=明显黄化伴茎部菌丝可见；3=严重黄化/坏死和萎蔫伴茎部菌丝上行；4=插条死亡。实验重复两次，数据计算标准误。

Rooted cutting inoculation

茎插条插入预浸生根溶液（Clonex Clone Solution）的岩棉块，覆盖塑料罩23–27°C培养2周（24小时光照），生根后移入8 cm塑料盆（4株/盆），盆下置9 cm培养皿保水。每盆加20 mL菌丝孢子悬浮液于茎周，盆置塑料盘覆盖塑料罩保湿。1和2周后记录黄化或矮化症状及根 discoloration，2周评级后将植株移入灭菌椰糠:蛭石（3:1）混合物的15 cm盆，30°C生长箱培养3周后记录症状。实验重复两次，从病组织 re-isolations，PDA+S培养后PCR确认物种。

Hydroponic inoculations

生根插条插入深水培容器杯座，容器连接气泵持续曝气，两组容器：初始根和叶观察用28×14×19 cm（6 L Current Culture H₂O?营养液），根体积观察用40×27×15 cm（8 L营养液）。插入6插条后装置置于架子上18小时光照（54-watt 6400k T5HO灯），2周后容器加100 mL PBD培养的接种物（G. sylvaticum、F. commune、F. equiseti和F. sporotrichioides个体接种及G. sylvaticum+F. commune复合接种），设未接种对照。营养液每周更换，培养3周，每周观察根和叶生长，评级根 discoloration和坏死。接种3周后取出植株，记录叶和根健康状况，8 L容器中6株植株总根重50°C烘干48小时后测定。实验重复两次。

Results

Isolation from plant tissues and molecular identification

2023早春 symptomatic大麻根组织在PDA获得多个独特菌落（Fig. 2c,d），经ITS1-ITS4区和/或EF-1α区PCR鉴定为Fusarium commune、F. equiseti、F. sporotrichioides和Globisporangium sylvaticum分离物，与GenBank代表分离物序列相似性99.8–100%。

2023年8月田间重复采样 older symptomatic植株根和冠部组织（Figs. 3,4），分离出相同四种真菌和卵菌物种及F. acuminatum（Table 1），后者出现频率低（<5%）。 affected基因型为‘Star Killer’、‘Grandaddy Bruce’和‘Red Dragon’，症状包括整体黄化和生长迟缓（Fig. 3）。所有五种真菌和卵菌物种从各基因型分离，F. commune在‘Red Dragon’最常见，G. sylvaticum在‘Star Killer’最常见（Table 1）。所有物种在PDA+S和PDB生长良好，产生独特菌落形态和特征色素（Fig. 5）。F. commune和F. equiseti幼菌落相似（白色絮状气生菌丝），但后者菌落边缘不规则且底面呈浅米色，而F. commune底面淡粉色（Fig. 5c,d）。此外，F. equiseti菌落生长更快。F. sporotrichioides和F. acuminatum分别产生 distinct红色或粉米色素，前者生长远快于后者（Fig. 5c,d）。菌落近3周龄时，F. equiseti上表面 develop米色素，而F. commune保持白色（Fig. 5e,f）。土壤稀释涂布PDA+S培养7天后基于独特菌落形态确认所有Fusarium种和Pythium菌落存在。

20°C培养7天后，G. sylvaticum和F. sporotrichioides菌落生长最快，其次为F. equiseti和F. commune（Fig. 6a）。30°C时所有物种生长加速，7天后菌落直径相当（Fig. 6b）。F. commune代表分离物在PDA+S的形态特征如Fig. 7所示：初始产生白色絮状气生菌丝，中心淡粉色（Fig. 7a），随时间底面 develop淡粉至鲑鱼色（Fig. 7b），老菌落（4周龄）可见同心圆状致密菌丝（Fig. 7c,d），Fig. 7e,f显示3周龄菌落的 microconidia和年轻 macroconidia。频繁传代后，F. commune菌落底面 develop红紫色素，类似F. oxysporum（Fig. 8g,h）。

利用EF-1α序列（GenBank登录号PQ336775）进行系统发育分析，大麻分离物与大量宿主来源的F. commune分离物聚为一支，与F. oxysporum明显分开（Fig. 8）。与既往研究中大麻病株分离的五种Fusarium物种序列比较，F. commune独特分离（Fig. 9）。

除根和冠部组织分离的五种最常见真菌和卵菌物种外，13份叶样本中9份确认HLVd存在，均来自‘Grandaddy Bruce’基因型个体 symptomatic植株。尽管存在严重卷叶症状，未检测到BCTV。HLVd阳性植株整体褪绿，部分植株较健康株矮化（Fig. 10a–d），HLVd感染植株 developing花序变小且褪绿（Fig. 10d–f）。HLVd确认基于特征256 bp RNA条带，13株中9株出现（Fig. 10g），条带纯化测序与温室栽培大麻HLVd分离物100%相同。

Pathogenicity experiments

Stem cutting inoculations

‘Powdered Donuts’插条基部加2 mL四种Fusarium种和G. sylvaticum的菌丝孢子接种物，高湿条件下培养4周，部分物种导致 visible菌丝生长和插条死亡（Fig. 11）。F. commune colonization最快（Fig. 11b,c），菌丝2周内茎部上行10–15 cm，导致插条快速死亡。对照插条健康（Fig. 11a）。F. sporotrichioides菌丝茎部上行5–8 cm，部分插条4周后死亡（Fig. 11d）。F. acuminatum接种插条4周后萎蔫，茎部菌丝生长仅5 cm（Fig. 11e）。F. equiseti和G. sylvaticum茎部菌丝生长极少，接种插条保持健康。两次重复实验的每周病害严重度评级如Fig. 12所示，数据证实F. commune生长极旺盛，插条快速死亡，其次为F. sporotrichioides。F. equiseti和G. sylvaticum该 assay中弱致病（Fig. 13）。

Rooted cuttings inoculations

生根插条加20 mL接种物于4重复植株，置塑料盆覆盖塑料罩培养2周（Fig. 13a）。与未接种对照相比，接种F. commune、G. sylvaticum和F. sporotrichioides导致根长减少和 visible根褐变（Fig. 13b），F. commune和G. sylvaticum根褐变最严重（Fig. 13c）。植株移入椰糠:蛭石生长介质3周后，接种G. sylvaticum和F. commune植株矮化最明显，其次为F. sporotrichioides（Fig. 13d）。病组织 re-isolations获得预期病原。

Hydroponic inoculations

水培营养液生长2周后，大麻插条 develop茂密叶和根（Fig. 14a,b），后加100 mL三种Fusarium种和G. sylvaticum接种物（未包括F. acuminatum）。接种1周后，F. equiseti处理根与未接种对照无 visible差异（Fig. 14c,d），F. sporotrichioides接种根 visible褐色（Fig. 14e），F. commune或G. sylvaticum处理根体积 visible减少，多根开始腐烂（Fig. 14f,g）。接种3周后，根和叶类似趋势，F. equiseti处理植株与对照无 visible差异（Fig. 14h,i），F. sporotrichioides接种根褐变和生长减少（Fig. 14j），接种F. commune和G. sylvaticum植株矮化和根生长减少最严重（Fig. 14k,l）。

为观察病原接种对根生长和体积的负面影响，使用较大水培容器（8 L），接种3周后评估根和叶生长（Fig. 15a）。接种F. commune、G. sylvaticum和F. sporotrichioides植株生长比较如Fig. 15(b–d)所示（未包括F. equiseti），所有病原接种后叶和根生长 visible减少。F. commune和G. sylvaticum接种对根体积负面影响最显著，与未接种对照相比（Fig. 15f–h）。F. commune和F. sporotrichioides接种根色更深，G. sylvaticum对根体积负面影响最大。另实验在8 L水培容器评估这些病原个体及F. commune与G. sylvaticum复合接种对根健康的影响。与对照根相比（Fig. 16a），F. sporotrichioides接种导致根 discoloration无 visible体积减少（Fig. 16b），F. commune导致广泛褐变和腐烂伴 visible根体积减少（Fig. 16c），G. sylvaticum导致根褐变和根腐（Fig. 16d），F. commune与G. sylvaticum复合接种导致最严重根减少和 discoloration（Fig. 16e）。6株植株根干重测量支持这些观察，G. sylvaticum负面影响最大，其次为F. commune，F. sporotrichioides影响最小（Fig. 16f）。

Discussion

2018年加拿大法律通过后室外大麻种植增加，但较室内种植植株病原体研究少。本研究不列颠哥伦比亚省中部南部半干旱环境室外栽培大麻植株移植后早春出现生长迟缓、叶片黄化和卷叶症状，这些症状独特，不同于温室植株报道症状，出现于三种基因型。植株发育后期，整体叶片黄化、矮化和冠腐症状更符合根病原体感染所致。检测 symptomatic植株BCTV和HLVd，仅‘Grandaddy Bruce’基因型HLVd阳性，可能源自感染种子（已证明携带并传播该类病毒）。类病毒感染减少花序发育，导致黄化和矮化，类似温室植株症状。此为加拿大室外栽培大麻HLVd感染首次报道。

本研究重点阐明从幼株和成熟 symptomatic植株分离的根感染病原复合体，包括四种Fusarium种和一种Globisporangium种。三种大麻基因型根最常见物种为F. commune和G. sylvaticum，其次为F. equiseti、F. sporotrichioides和较少程度F. acuminatum。这些物种也从 affected植株根际土壤样本稀释涂布分离。病原性研究显示，根组织分离的F. equiseti对大麻插条或生根植株无致病性，尽管其从表面消毒根频繁分离。既往研究证明F. equiseti对大麻植株弱毒力或非致病性，表明其可能为病组织次生入侵者。但其他研究提示F. equiseti可感染hemp植株叶和花组织。该物种分离物快速生长，初始形态可能与F. commune混淆。

生根大麻植株岩棉和水培接种研究中最强致病病原为G. sylvaticum，但其接种未生根插条不引起症状。大麻未生根插条猝倒症状通常不归因Pythium spp.，而由多种不同Fusarium spp.引起。既往研究显示北美大麻和hemp作物最多五种Pythium物种引起根腐和萎蔫症状，但G. sylvaticum为北美首次报道C. sativa病原体。该物种寄主范围广，全球分布，引起多种作物根和冠腐及枯梢症状，导致矮化、褪绿和萎蔫，与田间大麻植株症状一致。例如，G. sylvaticum报道感染玉米、大豆、莴苣、马铃薯块茎、草莓植株、红松幼苗等。最适径向生长28°C至30°C，该温度下病原体24小时生长2.7 cm。大麻分离物培养4天后菌落直径8.5 cm，证实其极快生长速率。

本研究中大麻植株第二强毒力病原为F. commune，从 symptomatic植株根和冠部组织高频率分离。该病原为加拿大首次报道感染C. sativa，但近期报道其为美国宾夕法尼亚州室内设施栽培大麻的破坏性病原体。其未从加拿大温室栽培大麻分离，但其对大麻插条和根的症状学视觉难以区分F. oxysporum感染。F. commune最初从多种植物物种分离描述，证明与F. oxysporum密切 related但 distinct物种。这两个密切 related姐妹分类单元可利用EF-1α基因序列区分，如本研究及许多既往研究所述。此外，扩增片段长度多态性（AFLP）标记和线粒体小亚基rDNA（mtSSU）及rDNA内部转录间隔区（ITS +5.8S）测序用于区分这两个密切 related物种。已描述定量PCR方法区分影响花旗松幼苗的F. commune和F. oxysporum及定量土壤种群。F. commune基因组和转录组序列近期发表。

F. commune寄主范围极广，报道引起花旗松和其他针叶树幼苗根和冠腐及猝倒症状、水稻植株、烟草植株、百合鳞茎、马铃薯块茎、辣根根、山药块茎、番茄植株、莲藕根茎、人参植株、甘蔗、玉米、大豆、苜蓿、草莓植株和百日菊花茎。加拿大报道该病原引起 field豌豆根腐和大豆根腐（与F. acuminatum联合）。病原体产生多种纤维素分解和木质纤维素分解酶，破坏植物组织。大麻植株种植田块前期种植苜蓿（对F. commune敏感），并有原生草类和山艾树存在。先前用作放牧地。可能土壤F. commune和G. sylvaticum种群足够高，导致移植大麻植株早季感染和植株发育后期感染，引起观察症状。

F. commune与大麻植株冠腐症状相关，以及根腐和根 discoloration。纯培养中分离物20–30°C生长良好，表明其宽温度范围。观察到F. commune分离物较针叶树幼苗上F. oxysporum高毒力，两物种常多种寄主上共同出现。本研究中，F. commune引起大麻插条感染较既往研究报道F. oxysporum更快，表明其可能较大麻植株上F. oxysporum更强毒力。需要努力监测该新描述病原体在加拿大大麻种植设施的分布。G. sylvaticum和F. commune联合接种实验导致更严重根 discoloration和根腐，指出该病原复合体田间条件下影响大麻植株可能更高病害严重度。

本研究首次报道F. sporotrichioides引起北美大麻根腐，尽管先前报道感染温室栽培植株花序组织，导致芽腐。谷物作物上，F. sporotrichioides为引起头疫病或小麦赤霉病的真菌复合体一部分，报道产生霉菌毒素包括A型单端孢霉烯族毒素如T-2毒素、HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇和双醋酸基藨草镰刀菌烯醇。该病原体报道感染曼尼托巴省大豆植株根并引起根腐，以及南达科他州和阿尔伯塔省鹰嘴豆植株。大麻植株上，该病原接种后根 visible褐变/红变和后续根腐烂。感染植株矮化，但较G. sylvaticum或F. commune感染植株轻，表明其大麻根上较弱毒力。F. acuminatum本研究 symptomatic大麻植株低频率分离，但该物种人工接种后 capable引起插条萎蔫和茎腐。此为F. acuminatum大麻植株潜在致病能力首次报道。由于感染组织分离频率低且培养生长慢，未进一步研究该病原体。F. acuminatum先前报道为大豆和马铃薯植株根腐复合体一部分，可能类似大麻植株复合体一部分。

室外栽培条件下，管理该影响大麻植株的根腐复合体可用推荐控制措施少。出现症状后，该作物生产者移除并销毁所有 symptomatic植株，确保根区不过度积水。 affected植株发病率低于10%，似乎有其他几种基因型较采样三种基因型受影响轻。选择耐病基因型和移除病株为管理不列颠哥伦比亚省田间栽培大麻该根腐复合体唯一推荐文化控制措施。