拟南芥 halleri 金属超积累的分子机制：顺式调控元件招募核心生物钟因子 CCA1 增强 HMA4 表达

为解决植物金属超积累和耐性机制不明的问题，研究人员开展拟南芥 halleri 中 HMA4 基因表达调控机制研究。通过启动子删除与突变分析，发现金属超积累元件 MHE1 和 MHE2 是增强表达的关键，其中 MHE2 招募核心生物钟因子 CCA1 介导转录提升与昼夜节律调控。该研究揭示了植物极端性状进化的顺式调控新机制，为作物重金属修复育种提供新靶点。

　　

在自然界中，部分植物演化出惊人的金属超积累能力，能够在富含重金属的土壤中茁壮成长，并将高浓度重金属储存在地上部分。这一现象不仅为植物适应极端环境提供了 fascinating 范例，更是植物修复技术和可持续农业的重要研究方向。其中，阿拉伯芥属的 Arabidopsis halleri（ halleri 拟南芥）作为锌/镉超积累的模式物种，与其近缘非超积累物种 Arabidopsis thaliana（ thale cress 拟南芥）形成鲜明对比。前期研究表明， halleri 拟南芥中 HEAVY METAL ATPase 4（HMA4）基因的表达水平显著升高，是驱动金属超积累与耐性的关键因子。然而，导致这种表达差异的精确分子机制，特别是顺式调控元件的变异与作用方式，长期以来悬而未决。

为了回答这一关键问题，由 Leonardo Castanedo、Ute Kr?mer 等研究人员组成的国际团队在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现， halleri 拟南芥中 HMA4 基因的高表达源于其启动子区域中两个特定的顺式调控元件——金属超积累元件（Metal Hyperaccumulation Elements, MHEs）。这些元件通过招募核心生物钟相关的转录因子 CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1（CCA1），不仅大幅增强了基因的转录水平，还赋予了其独特的昼夜表达节律。这一发现将植物对重金属的极端适应性与古老的生物钟调控网络联系起来，为理解植物性状的进化创新提供了崭新的视角。

本研究综合运用了启动子功能分析（包括系列缺失构建体、定点突变和嵌合启动子实验）、稳定转化的转基因拟南芥报告基因系统（GUS 报告基因）、RT-qPCR 定量基因表达、蛋白酶活检测、组织化学染色、生物信息学 motif 分析与比对，以及遗传学方法（利用 cca1 突变体和过表达体进行杂交验证）。研究所用的 halleri 拟南芥材料来自德国 Langelsheim 种群（Lan3.1 accession），而 thaliana 拟南芥则采用哥伦比亚生态型（Col-0）。

研究结果

Identification of regions governing functional divergence between the AhHMA4-1 and the A. thaliana HMA4 promoter

通过构建 AhHMA4-1 和 AtHMA4 启动子的系列缺失片段并驱动 GUS 报告基因在 thaliana 拟南芥中稳定表达，研究人员鉴定出两个关键区域。在 AhHMA4-1 启动子中，远端区域（DR, -1602 至 -698 bp）和近端区域（PR, -130 至 -86 bp）被确定为“增强区域1和2”，它们的缺失导致报告基因活性急剧下降。相反，在 AtHMA4 启动子中，其远端区域和 5'UTR 中的内含子被鉴定出具有复杂的、主要作用于翻译水平的抑制功能。这些结果表明， halleri 和 thaliana 拟南芥 HMA4 启动子的功能差异源于特定的增强性与抑制性顺式元件的差异。

All three AhHMA4 gene copies share two homologous enhancing cis-regulatory regions

对 halleri 拟南芥中三个串联复制的 HMA4 基因（AhHMA4-1, -2, -3）的启动子进行平行分析发现，上述两个增强区域（ER1 和 ER2）在所有三个拷贝中都是功能保守的。删除任一区域的同源部分都会导致报告基因活性的显著降低，这表明尽管存在序列上的细微差异，但增强高水平转录的机制在三个基因拷贝中是通过相似的顺式调控逻辑实现的。

Identification of conserved cis-regulatory elements in the A. halleri HMA4 promoters

通过精细的缺失分析和跨多个 halleri 种群材料的生物信息学比对，研究者在 ER1 和 ER2 区域内鉴定出高度保守的短序列 motif。在 ER1 中鉴定出核心序列为 TGTAACC 的元件，命名为 Metal Hyperaccumulation Element 1 (MHE1)。在 ER2 中鉴定出一对核心序列为 TATC(T/A) 的元件，命名为 Metal Hyperaccumulation Element 2 (MHE2)。值得注意的是，MHE2 的序列与已知的 Evening Element (EE, AAATATCT) 高度相似，而 EE 是生物钟核心转录因子 CCA1 的经典结合位点。

AhHMA4-1 promoter-dependent transcript levels require CCA1

生物信息学预测表明 MHE2 最可能的结合蛋白是含有 MYB 结构域的转录因子，特别是 REVEILLE 家族（包括 CCA1）。基因表达分析发现，在 thaliana 拟南芥中，由 AhHMA4 启动子驱动的报告基因表达呈现出明显的昼夜节律性，峰值出现在授时因子时间 9（ZT9，光照开始后9小时），而 AtHMA4 启动子则无此节律。将 AhHMA4-1 启动子中的 MHE2 突变后，其驱动的高表达水平和昼夜节律均消失。更重要的是，通过遗传杂交将 AhHMA4-1 报告基因导入 cca1 功能缺失突变体背景中时，其报告基因表达水平显著降低至与 AtHMA4 启动子相当的水平，且昼夜节律消失。而在 CCA1 过表达植株中，AhHMA4-1 启动子的节律性被消除。这些实验证明，AhHMA4 启动子的高活性和节律性严格依赖于 MHE2 元件和 CCA1 因子的功能。

Diel regulation of HMA4 transcript levels in A. halleri

最终，研究在 halleri 拟南芥本体中验证了上述发现。RT-qPCR 分析证实，内源的 AhHMA4 基因转录本在 halleri 的叶片和根中均表现出显著的昼夜波动，峰值出现在 ZT9 左右，这与在转基因报告中观察到的节律一致。而在 thaliana 拟南芥中，AtHMA4 的转录本水平始终很低且无节律。同时， halleri 中 CCA1 的转录本水平在叶片中高于 thaliana，其节律相位与 CCA1 作为早晨基因的特征相符，为进一步的转录调控提供了线索。

研究结论与意义

本研究得出了结论： halleri 拟南芥中 HMA4 基因的高表达是由其启动子区特定的顺式调控元件 MHE1 和 MHE2 所决定的。其中，MHE2 元件通过模仿 Evening Element，成功地“劫持”或“协同利用”（co-opt）了核心生物钟转录调控网络中的关键因子 CCA1，从而实现了对 HMA4 转录的增强和昼夜节律性调控。这种机制在 halleri 拟南芥的三个 HMA4 基因拷贝中都是保守的。与之相比， thaliana 拟南芥的 HMA4 启动子不仅缺乏这些增强元件，还进化出了独特的翻译抑制机制。

该研究的发现具有多重重要意义。首先，它从分子机制上揭示了植物极端性状（金属超积累与耐性）进化的一个新颖模型——即通过顺式调控元件的微小变异来协同利用已有的、保守的转录调控网络（如生物钟），从而实现基因表达量的巨大改变和新的表达模式。这为理解“进化创新”提供了经典范例。其次，研究鉴定出的 MHE 元件及其互作因子 CCA1，为未来通过合成生物学或基因编辑手段改良作物重金属耐受性与积累能力提供了潜在靶点，在植物修复和食品安全领域具有应用前景。最后，发现重金属稳态与生物钟调控这两个重要生理过程之间存在直接联系，暗示了生物体在不同时间尺度上协调资源分配与应激反应的复杂性和精巧性。