麋鹿螺旋体相关蹄病（TAHD）的微生物组学研究揭示多细菌病因及其地理分布一致性

本研究发现麋鹿螺旋体相关蹄病（TAHD）具有显著的多细菌病因特征，通过16S rRNA基因测序和新型组织学分类系统，揭示了Treponema、Mycoplasma和Fusobacterium等菌属在TAHD病变中的富集现象及地理分布的高度保守性，为开发新型诊断方法和靶向治疗策略提供了重要依据。

　　

ABSTRACT

Treponeme-associated hoof disease（TAHD）是一种新兴的传染性疾病，主要影响北美野生麋鹿（Cervus canadensis），其特征为溃疡性化脓性蹄皮炎伴螺旋体感染，导致跛行和死亡率上升。尽管TAHD被假设为多细菌病因，其致病机制及病原体在不同地理分布区的特征仍不明确。本研究开发了一套针对蹄部病变的组织学分类系统，并采用16S rRNA基因扩增子测序技术，对来自TAHD流行区、散发区及未发现区的129例野生麋鹿样本中的细菌群落进行了系统分析。

INTRODUCTION

TAHD自21世纪初在华盛顿州西南部首次报道以来，已逐渐扩散至美国西北部多个地区。该病的典型病变包括蹄部溃疡、蹄壳过度生长、蹄球部侵蚀及蹄囊脱落等，但其临床表现并不具特异性，因此目前的诊断仍依赖于组织病理学检查，即发现银染阳性的螺旋体及伴随的中性粒细胞炎症。近年来，基于16S rRNA测序、选择性培养及PCR技术的研究表明，TAHD与Treponema属细菌密切相关，该属细菌亦在牛、羊等家畜的蹄部疾病如牛数字皮炎（BDD）和传染性羊数字皮炎（CODD）中起关键作用。

与BDD类似，TAHD的病变中还持续检测到Mycoplasmataceae、Fusobacteriaceae和Porphyromonadaceae等科的细菌，进一步支持其多细菌病因假说。然而，既往研究多基于大体病变的观察，缺乏系统性组织学评估以及大样本的地理分布比较，限制了对其病原体组成及地理变异模式的深入理解。

MATERIALS AND METHODS

样本采集与处理

研究样本来自2018–2021年间美国西部及中部多个地区，包括TAHD流行区（如华盛顿西部和加利福尼亚北部）、散发区（如爱达荷州北部、华盛顿中东部和俄勒冈州东北部）以及未发现区（南达科他州风洞国家公园）。蹄部样本在采集后经清洗、大体评估并拍摄记录，随后使用无菌穿刺活检钳采集约100 mg的蹄间皮肤及皮下组织，保存于Allprotect试剂中并于-70°C至-80°C冷冻直至DNA提取。

组织学分类与诊断

本研究提出了一套新的组织学分类系统，将蹄部病变分为四类：正常表皮（H_ne）、角质层内坏死细胞碎屑（H_nd）、脓疱性皮炎（H_pu）以及糜烂至溃疡性皮炎（H_eu）。通过HE染色和Warthin-Starry（WS）银染确认螺旋体的存在，并将同时具备中性粒细胞炎症和银染阳性螺旋体的病例定义为TAHD阳性。

DNA提取与16S rRNA测序

组织样本经机械破碎与蛋白酶K消化后，使用ZymoBIOMICS Miniprep Kit提取总DNA。针对16S rRNA基因V3–V4区域进行扩增子测序，使用Illumina Nextseq平台，并通过DADA2流程处理原始数据，剔除嵌合体并注释 taxonomy。

数据分析

使用Shannon多样性指数（SDI）和Bray-Curtis距离矩阵评估α和β多样性，并采用ANCOMBC2进行差异丰度分析，以识别与TAHD显著相关的操作分类单元（OTUs）。通过Spearman相关性分析探讨不同菌属之间的共生关系。

RESULTS

样本特征与组织学分类

在129例样本中，57%的病例存在中性粒细胞炎症（H_pu或H_eu），其中69%同时检测到螺旋体，被判定为TAHD阳性。大体病变分级与组织学结果之间存在一定不一致性，例如19%的大体异常样本最终组织学诊断为TAHD阴性，突显了组织学确认的必要性。

微生物群落多样性

TAHD阳性样本的Shannon多样性指数显著高于阴性样本（P<0.05），且随着病变严重程度增加（从H_ne到H_eu），群落多样性逐步上升。Bray-Curtis距离分析显示，TAHD阳性与阴性样本间的微生物组成存在显著差异。

TAHD相关细菌OTUs

在属水平上，Treponema、Mycoplasma、Fusobacterium及未分类Spirochaetaceae在TAHD阳性样本中显著富集（LFC>2，P<0.05），且在这些样本中的检测频率高达73%–84%，而在TAHD阴性样本中极少或完全未检测到。在ASV水平上，T. pedis、M. hyopharyngis、F. necrophorum等多个ASV表现出与TAHD病变严重程度正相关的富集趋势。

细菌相关性分析

Spearman相关性分析显示，Treponema与Mycoplasma之间存在极强的正相关（ρ=0.9，P<0.05），同时二者还与Fusobacterium、Peptococcus等多个属显著正相关，提示这些细菌可能在TAHD病变中形成协同作用的微生物联盟。

地理分布比较

尽管TAHD在流行区和散发区的发病率存在差异，微生物组成却高度保守。仅少数ASV（如未分类Spirochaetaceae sp66603和T. phagedenis）在两地之间存在显著分布差异，但其在整体群落中的占比较低，表明地理环境因素可能通过影响宿主或环境微生物组间接影响TAHD的流行病学特征。

DISCUSSION

本研究通过大样本多地区的微生物组分析，证实TAHD是一种多细菌协同作用的疾病，其中Treponema、Mycoplasma和Fusobacterium是核心致病菌群。它们不仅在TAHD病变中高度富集，还表现出显著的协同正相关性，提示可能在生物膜形成、免疫逃逸或组织侵袭中发挥共同作用。值得注意的是，本研究首次报道Corynebacterium freneyi-xerosis在TAHD病变中的富集现象，其在不同地理区域间的差异分布可能与环境湿度及病变慢性程度有关。

此外，组织学分类系统的建立为TAHD的精确诊断与病变发展阶段评估提供了重要工具。大体病变与组织学结果的不一致再次强调，单纯依赖肉眼观察可能导致误诊，需结合分子检测与病理学确认。

未来的研究应聚焦于病原体的功能验证、宿主-微生物互作机制以及基于关键病原ASV的诊断技术开发。同时，针对不同地理区域的环境因素及其对微生物群落的影响开展深入研究，将有助于制定区域特异性的TAHD防控策略。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢华盛顿州鱼类与野生动物管理局、风洞国家公园、爱达荷州渔业与狩猎局等多个机构在样本收集中提供的协助。本研究获得华盛顿州政府专项经费及ARCS基金会奖学金支持。