佐剂依赖性SARS-CoV-2刺突疫苗保护机制研究：不同人用制剂免疫原性比较及其对奥密克戎变异株的交叉保护作用

本研究发现采用Montanide ISA720佐剂的重组蛋白疫苗能诱导强烈的体液免疫（包括针对Omicron变异株的中和抗体）和强大的T细胞免疫（IFN-γ产生），在年轻和老年小鼠模型中均展现出卓越的保护效果，为优化COVID-19疫苗设计提供了关键科学依据。

　　

ABSTRACT

尽管采用不同佐剂系统的重组疫苗已在全球新型冠状病毒病（COVID-19）免疫接种中广泛部署，但其独特的免疫特征尚未完全阐明。本研究评估了四种经临床验证的佐剂——氢氧化铝（Al）、两种水包油乳液（Montanide ISA720和ISA51）和一种油包水乳液（Sepivac SWE）——与预融合稳定的祖先严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白三聚体（S-2P）在小鼠模型中诱导的免疫反应。S-2P:ISA720和S-2P:ISA51均引发了强烈的体液免疫，包括针对奥密克戎（Omicron）变异株的交叉中和抗体，以及在脾脏和肺部产生 robust 干扰素γ（IFN-γ）的T细胞反应。使用S-2P:ISA720免疫可对祖先病毒以及奥密克戎亚变体BA.5和BF.7的致死性攻击提供完全保护。相比之下，S-2P:Al和S-2P:SWE引发的抗体反应显著较弱，T细胞免疫检测不到，保护效力显著降低。S-2P:ISA720的初免-加强免疫诱导了针对同源SARS-CoV-2和奥密克戎BA.2亚变体的持续峰值抗体滴度，在接种后长达17周内提供完全保护。虽然在初免-加强方案后接种第三剂S-2P:Al引发了抗体水平的强劲增加，但此后滴度迅速下降，重现了第二次接种后观察到的衰减动力学。ISA720和Al制剂均表现出抗体反应和保护效力的年龄依赖性下降。值得注意的是，老年小鼠在SARS-CoV-2攻击后表现出显著减弱的神经炎症反应，并且在过继转移免疫血清后保护作用显著受损。这些结果强调了广谱和持久免疫的佐剂特异性决定因素，并揭示了疫苗诱导的针对SARS-CoV-2保护中存在新的年龄相关限制。

IMPORTANCE

持续的病毒进化、疫苗诱导免疫力的快速减弱以及老年人群的脆弱性仍然是COVID-19疫苗接种策略的主要挑战。本研究系统评估了祖先刺突蛋白与四种不同佐剂在小鼠模型中引发的免疫反应。我们证明优化的佐剂配方显著增强了抗体反应的强度和广度，增强了T细胞免疫力，并快速诱导针对同源病毒和奥密克戎变异株的持续峰值抗体滴度。疫苗诱导的抗体反应在老年小鼠中显著减弱，此外，抗体在病毒攻击时的保护效力以及炎症细胞因子反应在老年动物中也受到损害。这些结果提供了令人信服的证据，表明合理的佐剂选择对于使重组疫苗能够实现快速起效、广泛和持久的免疫保护至关重要。此外，我们的研究为观察到的老年人疫苗效力降低提供了新的机制见解。

INTRODUCTION

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行给人类健康以及全球社会经济发展带来了巨大损害，并且仍然对全球公共卫生构成威胁。自2025年初以来，全球许多地区出现了SARS-CoV-2感染的 resurgence。疫苗接种是控制传染病最有效的策略。SARS-CoV-2刺突蛋白通过其S1亚基的受体结合域（RBD）与人类细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合来实现病毒细胞进入。因此，刺突蛋白及其RBD作为中和抗体的主要靶点，并成为关键的疫苗抗原。几种疫苗被迅速开发并批准在全球进行大规模接种。这些疫苗已显示出对抗SARS-CoV-2感染的功效，特别是在减少重症疾病、住院和死亡率方面。然而，主要发生在病毒刺突蛋白中的免疫逃避变异株不断出现。值得注意的是，自2021年底以来，奥密克戎及其亚变体表现出明显的抗体逃避，对全球疫苗接种活动构成了重大挑战。此外，自然感染和疫苗接种引发的中和抗体通常随时间迅速减少。老年人尤其易感SARS-CoV-2感染并因疫苗接种后适应性免疫受损、炎症反应失调和年龄相关慢性疾病而发展为重症疾病。已采取多种策略来应对快速进化的病毒变异株和减弱免疫保护的挑战，包括加强疫苗接种、疫苗配方中的抗原更新以及开发基于多价抗原的疫苗。

目前，三种不同的疫苗平台技术——灭活病毒疫苗、基于mRNA的脂质纳米颗粒疫苗、复制缺陷型腺病毒载体疫苗和佐剂重组蛋白疫苗——可用于商业化的COVID-19预防。其中，佐剂重组蛋白疫苗表现出独特的优势，包括卓越的安全性、增强的稳定性、更高的成本效益以及改进的生产可扩展性。这些好处使重组蛋白疫苗成为全球免疫工作中特别有价值的选择。

佐剂是重组疫苗的关键组成部分，协调抗原呈递给免疫细胞以及有效免疫启动所需的免疫刺激信号传递。佐剂深刻影响对疫苗抗原的免疫反应的强度、广度和质量。尽管多种佐剂系统，从传统的铝盐到新配方，如油包水（O/W）乳液AS03和基于皂苷的Matrix-M纳米颗粒，已用于重组COVID-19疫苗，但这些不同佐剂诱导的各自独特的免疫特征仍有待完全阐明。

铝盐佐剂（主要是氢氧化铝和磷酸铝）是人类疫苗中使用最广泛的佐剂。它们通过多种机制发挥作用，包括形成允许持续释放的抗原储存库、诱导局部炎症反应以及激活先天免疫通路。虽然能有效增强抗体介导的免疫力，但这些佐剂主要引发Th2偏向的免疫反应，细胞免疫力诱导较弱。这种Th2偏向对呼吸道病毒疫苗提出了潜在的安全考虑，因为它可能在某些情况下导致疫苗相关增强性呼吸道疾病（VAERD）。

水包油（W/O）乳液佐剂与铝盐佐剂相比表现出卓越的免疫原性，特别是在引发T细胞介导的免疫力方面，其在人类疫苗中的应用一直在稳步增加。其中，Seppic的Montanide ISA 720和ISA 51代表了成熟的水包油乳液平台，几十年来已针对各种传染病和癌症的候选疫苗进行了广泛的临床评估。这些佐剂在增强抗原特异性抗体产生和细胞毒性T淋巴细胞反应方面已被证明有效。这些佐剂的免疫刺激特性主要涉及抗原储存库的形成、局部炎症反应和注射部位的淋巴细胞 trapping。虽然两者都是水包油乳液，但它们的组成有很大不同。ISA 720使用可代谢的角鲨烯作为其油相，提供优异的生物相容性，而ISA 51使用不可代谢的矿物油，通常引发更强的局部炎症，这一特性可能有助于其增强刺激T细胞介导免疫的能力。Sepivac SWE代表了一个新一代油包水乳液平台，类似于另一种油包水佐剂MF59。所有三种佐剂（ISA 720、ISA 51和SWE）在SARS-CoV-2候选疫苗的I/II期临床试验中均表现出良好的安全性和免疫原性。

在本研究中，我们在野生型C57BL/6小鼠和同源人源化ACE2转基因小鼠中评估了氢氧化铝和Seppic的Montanide ISA 720、ISA 51以及Sepivac SWE——与预融合稳定的祖先SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体（S-2P）组合使用的情况。我们的评估包括多个保护性免疫参数：（i）免疫反应的强度和广度，（ii）免疫的持久性，（iii）老年小鼠的保护效力，以及（iv）加强免疫的效果。

MATERIALS AND METHODS

细胞、病毒和蛋白质

HEK293T和HEK293细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。通过用表达人ACE2的慢病毒感染HEK293细胞，然后进行嘌呤霉素筛选，产生了稳定表达人ACE2的HEK293细胞（HEK293-ACE2）。Vero E6细胞由复旦大学张荣博士惠赠。HEK293T、HEK293-ACE2和Vero E6细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、1% L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO?条件下培养。FreeStyle CHO-S悬浮细胞（Invitrogen, USA）在补充有1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的EX-CELL 325 PF CHO无血清培养基（Sigma-Aldrich）中培养。细胞在无热原、带通风口的聚碳酸酯锥形瓶（Thermo Fisher Scientific）中于37°C、5% CO?、恒定130 rpm摇床培养箱中维持。所有SARS-CoV-2病毒均从核酸阳性病例的鼻咽拭子样本中分离，随后如先前所述在Vero E6细胞中传代和滴定。病毒株包括：SARS-CoV-2祖先毒株（GenBank: MT622319.1）、奥密克戎BA.2（GenBank: MT627325.1）、奥密克戎BA.5（GenBank: PQ213095.1）和奥密克戎BF.7（GenBank: PQ351184.1）。对应于祖先、Delta和奥密克戎变异株的SARS-CoV-2 S1蛋白、S2蛋白和RBD蛋白购自 Sino Biological（北京，中国）。

刺突蛋白表达

祖先SARS-CoV-2刺突三聚体胞外域的哺乳动物细胞密码子优化cDNA由Generay Biotech Co., Ltd（上海，中国）合成，其中将T4噬菌体纤维蛋白（Tfd）的三聚体foldon融合到SARS-CoV-2刺突胞外域（残基1–1,211；GenBank: NC_045512.2）的C末端，弗林蛋白酶切割位点RRAR被GSAS取代，并引入两个脯氨酸突变（K986P/V987P）以稳定预融合构象，同时带有C末端多组氨酸标签用于纯化。将该cDNA克隆到修饰的pCI-GS CHO表达载体中并电转染CHO细胞，随后使用含有25 μM甲硫氨酸亚砜亚胺（Sigma）的谷氨酰胺缺陷培养基筛选稳定表达刺突三聚体的克隆。将选定的克隆逐步放大至200 mL培养体积，之后收获上清液并通过超滤、镍亲和层析和脱盐顺序纯化。纯化的重组蛋白（命名为S-2P）通过BCA测定法（Thermo Fisher Scientific）定量，纯度通过考马斯亮蓝染色和在变性和非变性条件下的S1结构域特异性蛋白质印迹验证。

S-2P与人ACE2结合的测定

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）评估S-2P与人ACE2的结合。简言之，将S-2P蛋白（2 μg/mL）包被在高结合力96孔板（Thermo Fisher Scientific）上，并在4°C下孵育过夜。用PBST（含有1% Tween-20的PBS）洗涤后，用封闭缓冲液（含有1% BSA的PBST）在室温下封闭2小时。再次用PBST洗涤后，将连续稀释的人ACE2蛋白（mFc Tag；Sino Biological，北京，中国）加入板中，并在室温下孵育2小时。洗涤后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG1交叉吸附二抗（Invitrogen；1:1,000稀释），并在室温下孵育2小时。最后用PBST洗涤后，使用1-Step Slow TMB溶液（Thermo Fisher Scientific）显色，并用ELISA Stop Solution（Solarbio, China）终止反应。在450 nm处测量吸光度。

动物与伦理声明

C57BL/6小鼠购自上海吉辉实验动物护理有限公司（上海，中国），C57BL/6背景的CAG-hACE2转基因小鼠购自上海南方模式生物科技中心有限公司（上海，中国）。除非另有说明，实验小鼠为6-8周龄。老年组使用18月龄小鼠，因为标准实验室小鼠的平均寿命约为2年，18-24个月通常被认为是老年。所有动物均在无特定病原体（SPF）条件下的独立通风笼中饲养。所有动物实验均经海军军医大学医学伦理机构委员会审查批准，并按照中国《实验动物管理条例》进行。

小鼠免疫

将重组S-2P蛋白与 alum（Croda, Denmark）、Montanide ISA 720 VG、Montanide ISA 51 VG 或 Sepivac SWE（均来自 Seppic, France）配制，分别命名为 S-2P:Al、S-2P:ISA720、S-2P:ISA51 和 S-2P:SWE。每只小鼠肌肉注射100 μL疫苗制剂，其中含有10 μg S-2P蛋白，S-2P:ISA720、S-2P:ISA51 和 S-2P:SWE 的佐剂体积比分别为70%、50%和50%，而 S-2P:Al 含有100 μg氢氧化铝。除非另有说明，C57BL/6J 或 hACE2 小鼠以3周间隔免疫两次 S-2P:Al、S-2P:ISA720、S-2P:SWE 或 S-2P:ISA51，而对照动物仅接受PBS。

血清抗体测定

通过ELISA评估小鼠血清中对SARS-CoV-2的抗体。简言之，将重组SARS-CoV-2 S1、S2或RBD蛋白（1 μg/mL）包被在高结合力96孔板上，4°C过夜，然后用封闭缓冲液封闭。随后将连续稀释的血清样本加入板中，室温孵育2小时。充分洗涤后，加入HRP标记的二抗（山羊抗小鼠IgG、山羊抗小鼠IgG1或山羊抗小鼠IgG2b；Thermo Fisher Scientific）。终点滴度定义为显示450 nm吸光度值≥对照小鼠血清2.1倍的最高血清稀释度的倒数。

对于评估抗体抑制RBD-hACE2结合的竞争ELISA，将RBD包被（1 μg/mL）的96孔板首先与连续稀释的血清样本在室温下孵育2小时，然后加入hACE2蛋白（0.25 μg/mL）。洗涤后，加入兔抗hACE2抗体（Sino Biological）室温孵育2小时，随后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific）。其余步骤如上所述进行。

血清对真实SARS-CoV-2的中和作用

将Vero E6细胞接种在96孔板中（每孔1 × 10?个Vero E6细胞）并培养过夜。将连续稀释的血清样本与0.1 MOI（感染复数）的SARS-CoV-2祖先毒株或0.01 MOI的奥密克戎BA.2毒株在37°C下混合30分钟，然后将病毒-血清混合物在存在2 μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶的情况下加入Vero E6细胞。感染后24小时，用-20°C甲醇固定细胞30分钟，并用3% BSA封闭。加入针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP；Sino Biological，北京，中国）的兔多克隆抗体，4°C孵育过夜，随后用PBS洗涤，并与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific）在室温下孵育1.5小时。DAPI（Sigma-Aldrich）染色后，使用Cytation 5系统（BioTek, USA）成像。使用Gen5 3.10软件量化感染细胞数，中和百分比相对于仅病毒对照计算。50%抑制浓度（IC??）定义为显示50%感染抑制的血清稀释度的倒数，并使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software, Inc.）计算。

血清对假病毒的中和作用

使用Lipofectamine 2000试剂（Thermo Fisher Scientific）将HEK293T细胞与HIV衣壳包装质粒、含有EGFP报告基因的转移质粒以及含有SARS-CoV-2或SARS-CoV刺突基因的质粒共转染。在SARS-CoV-2刺突表达质粒中，编码刺突C末端19个氨基酸的片段被截短。孵育48小时后，收获含有假病毒的上清液，以1,000 × g离心10分钟，并储存于-80°C直至使用。对于中和试验，将测试血清的连续稀释样本与假病毒在37°C、5% CO?下预孵育30分钟，然后将混合物加入293T-ACE2靶细胞（接种密度为1 × 10?细胞/孔）。4小时后，更换为含有2% FBS的新鲜DMEM，并在感染后48小时使用Cytation 5细胞成像多功能读数仪（BioTek）量化EGFP阳性细胞。使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software）中的非线性回归分析计算中和滴度（ID50）。

酶联免疫斑点测定

使用干扰素γ（IFN-γ）ELISPOT试剂盒（Dakewe, China）评估小鼠中T细胞介导的免疫反应。在第二次免疫后14天分离脾脏和肺部细胞。简言之，将IFN-γ单克隆抗体预包被的ELISpot板用无血清ELISPOT培养基（Dakewe, China）200 μL/孔在室温下封闭5-10分钟。用400 μg/mL的祖先SARS-CoV-2 S1或S2蛋白刺激脾脏或肺部细胞（2 × 10?/孔），在37°C、5% CO?下孵育20小时。使用生物素化的检测抗体和链霉亲和素-HRP检测产生IFN-γ的细胞，随后使用S6 Ultra ImmunoSpot Reader（Cellular Technology Ltd.）进行斑点可视化，并使用ImmunoSpot 5.1.36软件（Cellular Technology Ltd.）进行量化。斑点形成细胞数作为抗原特异性T细胞反应的量度。

SARS-CoV-2攻击

在异氟烷麻醉下，给hACE2转基因小鼠鼻内接种50 μL含有SARS-CoV-2祖先毒株（1 × 102 PFU）、奥密克戎BA.5（1 × 10⁴ PFU）或奥密克戎BF.7（1 × 10⁴ PFU）的病毒悬液。每天监测小鼠的体重变化和存活率。在感染后4天（dpi），将一部分小鼠人道处死以收集组织（鼻甲、肺和脑）用于评估病毒载量和炎症因子，而其余小鼠则维持用于纵向存活分析。

病毒载量和炎症细胞因子的测量

通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析病毒RNA水平和炎症细胞因子基因表达。将来自小鼠的组织样本（脑、肺和鼻甲）在TRIzol Reagent（Invitrogen）中匀浆，根据制造商的方案提取总RNA。使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa, Japan）进行第一链cDNA合成，随后使用TB Green Premix Ex Taq II（TaKaRa, Japan）和以下基因特异性引物（5′→3′）进行定量PCR扩增：SARS-CoV-2核衣壳（N）基因（正向：AAGGCGTTCCAATTAACACCA，反向：TGCCGTCTTTGTTAGCACCA）；小鼠β-肌动蛋白（β-actin）（正向：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，反向：GCACAGGGTGCTCCTCAG）；IL-6（正向：TCGGAGGCTTAATTACACA，反向：TCATACAATCAGAATTGCCAT）；CCL2（正向：TCGGAACCAAATGAGATCAGA，反向：TAGCTTCAGATTTACGGGTCA）；和CXCL10（正向：AATTTAATGAAAGCGTTTAGCC，反向：ATTAGGACTAGCCATCCAC）。所有数据均归一化至β-肌动蛋白表达水平。

血清过继转移

通过将免疫血清过继转移给受体hACE2转基因小鼠进行被动免疫，以评估其对SARS-CoV-2攻击的保护效力。简言之，给hACE2转基因小鼠静脉注射0.1 mL来自加强免疫后14天收集的混合血清（来自 vaccinated 小鼠）或PBS处理的对照小鼠。血清转移后24小时，用活SARS-CoV-2祖先毒株鼻内攻击小鼠。每天监测体重直至感染后第4天，此时将小鼠人道处死进行病毒学和免疫学分析。通过qRT-PCR量化脑组织中的病毒RNA载量和炎症因子表达谱。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software）进行统计分析。组间比较酌情使用非配对或配对双尾Student’s t检验，而多组比较则通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey’s事后检验。统计学显著性定义为P < 0.05，符号表示如下：P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001；ns（不显著）表示P ≥ 0.05。

RESULTS

C57BL/6小鼠中对与不同人用兼容佐剂配制的祖先SARS-CoV-2刺突三聚体的免疫反应

祖先SARS-CoV-2的预融合稳定刺突三聚体在CHO细胞中表达并通过亲和层析纯化。纯化的蛋白，命名为S-2P，通过天然和变性SDS-PAGE以及使用靶向S1亚基的单克隆抗体（mAb）的蛋白质印迹确认。ELISA分析证明了可溶性人ACE2与固定化S-2P的剂量依赖性结合。此外，S-2P有效抑制了SARS-CoV-2在Vero-E6细胞中的感染。

评估了氢氧化铝（Croda, Denmark）和Seppic的Montanide ISA 720、ISA 51以及Sepivac SWE（Seppic, France）增强C57BL/6小鼠中对重组S-2P蛋白免疫反应的能力。小鼠以3周间隔肌肉免疫两次，每次10 μg S-2P蛋白，分别与氢氧化铝或Seppic佐剂配制（表示为S-2P:Al、S-2P:ISA720、S-2P:ISA51和S-2P:SWE）。在每次免疫后2周收集血清样本，并分析抗原特异性IgG和中和抗体。比较分析显示，免疫原性因使用的佐剂而异。S-2P:ISA720和S-2P:ISA51均诱导了比S-2P:Al或S-2P:SWE更强的抗体反应。来自S-2P:ISA720免疫小鼠的血清显示出最高水平的S1和S2特异性IgG、最强的抑制RBD与hACE2结合的能力，以及最有效的中和祖先SARS-CoV-2的活性（在第5周时分别比S-2P:Al、S-2P:SWE和S-2P:ISA51组高4.3倍、5.1倍和2.2倍）。

为了评估抗原特异性T细胞反应，在加强剂量后3周处死免疫小鼠。从脾脏和肺部制备单细胞悬液，然后用祖先S1或S2蛋白进行离体刺激。使用酶联免疫斑点（ELISpot）测定法量化产生IFN-γ的细胞。结果显示，用S-2P:ISA720或S-2P:ISA51免疫的小鼠在脾脏和肺部均表现出显著更强的抗原特异性T细胞反应，而S-2P:Al和S-2P:SWE未能诱导可检测的抗原特异性产生IFN-γ的T细胞。

S-2P疫苗在人源化ACE2小鼠模型中对致死性SARS-CoV-2攻击的佐剂依赖性保护

CAG-hACE2转基因小鼠是评估候选疫苗功效的宝贵小动物模型。尽管SARS-CoV-2感染影响上下呼吸道并诱导组织损伤，但病毒入侵中枢神经系统是该模型死亡的主要原因。我们以3周间隔两次免疫CAG-hACE2转基因小鼠（C57BL/6背景），每次10 μg S-2P蛋白与不同佐剂配制（每组14只小鼠），外加一个额外的S-2P:ISA720单剂量组（10只小鼠）。与在野生型C57BL/6小鼠中的观察结果一致，所有配方均有效诱导了抗RBD IgG和病毒中和抗体，其中S-2P:ISA720显示出卓越的免疫原性，在第5周时其中和滴度分别比S-2P:Al、S-2P:SWE和S-2P:ISA51高10.8倍、7.8倍和3.9倍。值得注意的是，单剂量S-2P:ISA720在诱导中和抗体方面优于两剂量S-2P:Al和S-2P:SWE，而S-2P:Al始终显示出比ISA51或ISA720配制疫苗更弱的反应。此外，S-2P:ISA51和S-2P:ISA720诱导了Th1偏向的免疫力（通过升高的IgG2b:IgG1比率证明），这与在野生型C57BL/6小鼠中观察到的 robust IFN-γ产生T细胞反应相关。

加强免疫后三周，用100 PFU的祖先SARS-CoV-2鼻内攻击小鼠。未接种疫苗的对照小鼠表现出快速的疾病进展，严重的体重减轻和在攻击后5天内100%死亡率。所有疫苗接种组均显示出不同程度的保护：S-2P:ISA720组表现出完全保护（100%存活，14/14），而S-2P:ISA51显示出85.7%的存活率（12/14）。相比之下，S-2P:SWE和S-2P:Al组表现出相对较低的保护率，分别为42.9%（6/14）和35.7%（5/14）。值得注意的是，即使是单剂量的S-2P:ISA720也提供了90%的保护（9/10存活者），突出了其卓越的功效。

为了阐明疫苗诱导的中和抗体的保护作用，我们分析了疫苗接种小鼠中体液免疫反应与存活率之间的相关性。S-2P:Al和S-2P:ISA720组显示出抗RBD IgG和中和抗体滴度之间的强相关性，而S-2P:SWE和S-2P:ISA51组显示出相对较弱的相关性，表明佐剂关键性地影响抗体反应的强度和功能质量。保护分析显示，中和抗体滴度≥3 × 103在S-2P:Al免疫小鼠中赋予完全保护（5/5），在S-2P:SWE免疫小鼠中赋予71%的保护（5/7）。由于S-2P:Al和S-2P:SWE免疫均未诱导可检测的T细胞反应，观察到的保护主要归因于中和抗体。

我们通过在 na?ve hACE2小鼠中进行被动免疫进一步证实了疫苗诱导抗体的保护效力。小鼠（每组n = 10）在SARS-CoV-2攻击前1天注射100 μL来自免疫或对照小鼠的混合血清。每组5只小鼠在感染后4天处死，用于分析脑病毒载量和细胞因子谱，而其余5只小鼠则监测临床结果。所有接受对照血清或来自S-2P:Al免疫小鼠血清的小鼠均表现出显著的体重减轻和死亡率。相比之下，Seppic佐剂疫苗免疫血清提供了部分保护，分别有1只、3只和3只接受来自SWE、ISA51和ISA720佐剂疫苗免疫小鼠血清的小鼠存活。小鼠脑组织中病毒滴度和促炎细胞因子水平的降低表明，疫苗诱导的抗体有效抑制了SARS-CoV-2神经侵袭并减轻了相关的神经病理损伤。

**ISA720佐剂的祖先S-2P对奥