工程化双特异性HER2xVEGF锚蛋白重复蛋白在靶向纳米生物技术应用中的突破

本研究针对HER2阳性乳腺癌治疗中存在的颅内转移和耐药性问题，开发了一种基于工程化双特异性锚蛋白重复蛋白（DARPins）的新型靶向平台。通过融合抗HER2（G3）和抗VEGF（Abicipar pegol）DARPin模块，并引入C端半胱氨酸进行位点特异性生物正交偶联，实现了对荧光染料、放射性核素螯合剂和细胞毒性药物连接体的高效修饰。表面等离子共振（SPR）证实所有生物偶联物均保持皮摩尔至纳摩尔级的双靶点结合亲和力，为精准肿瘤学的诊断成像、放疗和靶向给药提供了创新策略。

　　

在HER2阳性乳腺癌治疗领域，尽管曲妥珠单抗（trastuzumab）、帕妥珠单抗（pertuzumab）和抗体药物偶联物（ADC）如恩美曲妥珠单抗（T-DXd）取得了显著进展，但高达50%的晚期患者仍面临颅内转移和治疗耐药性的严峻挑战。这些挑战主要源于血脑屏障（BBB）穿透效率低、肿瘤血管生成介导的适应性耐药机制，以及传统抗体药物存在的分子量大（约150 kDa）、制造复杂和潜在免疫原性等问题。血管内皮生长因子（VEGF）作为关键的促血管生成因子，与HER2信号通路密切交互，共同促进肿瘤进展和转移。因此，同步抑制HER2和VEGF通路被视为改善肿瘤控制和克服耐药性的有前景策略。

为应对这些挑战，Chen和Bradbury在《Journal of Nanobiotechnology》上发表了创新性研究，开发了一种基于工程化双特异性锚蛋白重复蛋白（Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins）的模块化平台。DARPins是一类源于天然锚蛋白重复模体的工程支架蛋白，具有分子量小（约14-18 kDa per domain）、高稳定性、易生产性和低免疫原性等优势，使其成为抗体药物的理想替代品。本研究通过融合高亲和力的抗HER2 DARPin（G3）和抗VEGF DARPin（Abicipar pegol），并引入C端半胱氨酸进行位点特异性修饰，构建了HER2xVEGF双特异性DARPin conjugate，实现了对多种生物医学载荷的高效偶联。

研究采用的主要技术方法包括：分子克隆与重组表达（使用pET28a(+)载体和大肠杆菌BL21(DE3)系统）、蛋白纯化（镍亲和色谱和尺寸排阻色谱）、位点特异性生物偶联（通过硫醇-马来酰亚胺反应和应变促进的叠氮-炔环加成反应，SPAAC）、功能验证（流式细胞术、ELISA、表面等离子共振SPR结合动力学分析）、以及生物物理表征（圆二色谱热变性分析、SDS-PAGE和SEC-HPLC单体和二聚体定量）。所有实验均使用商业化重组蛋白（HER2 ectodomain和VEGF₁₆₅）和细胞系（NCI-N87胃癌细胞、BT-474和MDA-MB-231乳腺癌细胞）。

Cloning, expression, purification, and characterization

研究人员成功构建了含N端6xHis标签、TEV蛋白酶切割位点和C端半胱氨酸的HER2xVEGF双特异性DARPin基因，并实现了在大肠杆菌中的高效可溶性表达，产量达100-130 mg/L。通过两步纯化策略获得了高单体纯度的蛋白，SEC和SDS-PAGE分析证实了其分子量（约30.1 kDa）和可逆的二硫键介导二聚化现象。圆二色谱分析显示该蛋白具有高热稳定性（Tm = 74.5°C），支持其作为生物偶联平台的稳健性。

HER2/VEGF targeted binding assay of DARPins

通过流式细胞术和ELISA实验，验证了双特异性DARPin对HER2阳性细胞（NCI-N87和BT-474）的特异性结合，以及对VEGF₁₆₅的高亲和力（EC₅₀ = 14.4 ng/mL），且结合性能与单特异性DARPin对照相当，证实了双靶点功能的保留。

Site-specific azide modification of HER2xVEGF bispecific DARPins

利用Azide-PEG3-Maleimide linker对C端半胱氨酸进行修饰，生成了HER2xVEGF DARPin-azide conjugate。SEC分析显示，叠氮化修饰显著增强了蛋白的生化稳定性，在25°C储存23天后二聚体含量低于5%，远低于未修饰蛋白的40.5%，证明该修饰有效阻止了分子间二硫键的形成。

Proof-of-concept bioconjugation for nanobiotechnology applications

通过SPAAC点击化学反应，成功将双特异性DARPin-azide与多种DBCO功能化分子偶联，包括荧光染料（BP Fluor 647）、放射性核素螯合剂（DOTA和DFO）和可切割药物连接体（Val-Cit-PAB-MMAE）。SEC-HPLC和SDS-PAGE分析证实了偶联物的高纯度和结构完整性，且所有偶联物均保留了双靶点结合能力。

Dual antigen targeting by functional HER2xVEGF bispecific DARPin bioconjugates

SPR动力学分析表明，所有生物偶联物均保持了对HER2和VEGF₁₆₅的低纳摩尔级结合亲和力（K_D值约1-3 nM），尽管偶联后解离速率略有增加，但结合功能未受显著影响。这证明了位点特异性偶联策略对靶向结合界面的最小干扰。

研究结论强调，该双特异性DARPin平台具有高度的模块化和多功能性，能够通过位点特异性偶联策略整合成像、治疗和靶向递送功能，为精准肿瘤学提供了新型theranostic（诊疗一体化）工具。其双靶点抑制能力（HER2信号阻断和VEGF中和）结合放疗或细胞毒性药物递送，有望克服现有ADC药物的局限性，改善颅内递送效率并减少脱靶效应。此外，该平台的扩展性允许集成其他DARPin模块，靶向更多肿瘤相关通路，从而推动下一代多特异性药物的开发。未来研究将重点评估其药代动力学特性、肿瘤穿透能力和治疗有效性，以进一步验证其临床转化潜力。