真菌介导增强型硒与氧化锌纳米颗粒的绿色合成及其抗癌与抗生素耐药基因抑制活性研究

本研究针对日益严重的微生物抗生素耐药性问题，创新性地利用Alternaria alternata真菌通过固态发酵法绿色合成硒纳米颗粒(Se-NPs)和氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)。研究发现这两种纳米颗粒与青霉素、头孢曲松和头孢吡肟联用时可显著降低抗生素最小抑菌浓度，并通过下调耐药基因表达展现协同抗菌效应。同时证实纳米颗粒对MCF-7、A549和HePG-2癌细胞系具有选择性细胞毒性，且经γ射线辐照可提升三倍合成效率。该研究为开发新型抗菌抗癌制剂提供了环境友好型解决方案，对解决抗生素耐药危机具有重要意义。

　　

随着抗生素滥用导致的微生物耐药性问题日益严峻，全球面临"超级细菌"引发的治疗危机。传统抗生素研发速度远跟不上细菌变异速度，而现有抗癌药物也存在毒副作用大和耐药性问题。这种双重困境迫使科学家寻找突破性解决方案。纳米技术的兴起为这一领域带来新曙光，特别是金属纳米颗粒因其独特物理化学性质和抗菌机制与传统抗生素不同，被视为最有希望的替代方案之一。

在这项发表于《Microbial Cell Factories》的研究中，Mohamed等人创新性地利用内生真菌Alternaria alternata AUMC15177通过固态发酵甘蔗渣的方式，绿色合成了硒纳米颗粒(Se-NPs)和氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)，并系统评估了其抗菌、抗癌活性及对抗生素耐药基因的调控作用。

研究采用真菌固态发酵生物还原法合成纳米颗粒，通过X射线衍射(XRD)、高分辨透射电镜(HR-TEM)、动态光散射(DLS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)进行表征，采用微量肉汤稀释法和棋盘法测定最小抑菌浓度(MIC)和分级抑菌浓度指数(FIC)，通过实时荧光定量PCR检测耐药基因表达，采用MTT法检测细胞毒性，并利用γ辐照技术优化合成效率。

筛选与鉴定合成菌株

从柑橘树皮中分离到的Alternaria alternata AUMC15177（保藏号OR119850）能同时还原硒酸钠和硫酸锌，发酵液颜色分别变为深红色和白色沉淀，表明成功合成Se-NPs和ZnO-NPs。系统发育树显示该菌株与交替链格孢菌同源性达100%。

纳米颗粒表征分析

XRD图谱证实Se-NPs呈六方晶系结构（JCPDS No. 060326），ZnO-NPs为六方纤锌矿结构（JCPDS No. 361451）。Scherrer方程计算显示Se-NPs和ZnO-NPs尺寸分别为45.83 nm和61.77 nm，DLS检测平均粒径为51.96 nm和65.43 nm，多分散指数(PDI)为0.107和0.116。Zeta电位分别为-21.89 mV和-20.74 mV，表明颗粒稳定性良好。TEM显示两者均呈球形且单分散性良好。

合成机制推测

FT-IR分析显示在1013 cm^-1(Se-NPs)和1015 cm^-1(ZnO-NPs)处出现新特征峰，表明真菌代谢产物中的酰胺、酚类和羧基等官能团参与金属离子还原和颗粒封端稳定过程。研究提出真菌合成纳米颗粒的两阶段机制：首先通过生物还原将金属离子转化为零价态，随后通过生物分子封端形成稳定纳米结构。

细胞毒性评估

MTT实验表明Se-NPs对HePG-2、MCF-7、HFB-4和A549细胞的IC₅₀值分别为90.5、71.8、188.2和76.8 μg/ml，ZnO-NPs对应IC₅₀值为83.5、82.7、164.2和88.4 μg/ml。两种纳米颗粒对癌细胞表现出显著毒性，但对正常黑色素细胞(HFB-4)毒性较低，显示良好选择性。

抗菌活性与协同效应

Se-NPs和ZnO-NPs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌(E. coli)等耐药菌株表现出广谱抗菌活性，MIC值分别为0.125 mg/ml和0.5 mg/ml。与抗生素联用时，头孢曲松、青霉素和头孢吡肟的MIC值降低4-32倍。棋盘法显示Se-NPs/ZnO-NPs与头孢吡肟联用对MRSA菌株呈协同效应(FIC指数<0.5)，对大肠杆菌菌株呈相加效应(FIC指数0.5-2)。

耐药基因表达调控

qPCR分析表明，单独使用抗生素时MRSA DSMZ28766和大肠杆菌DSMZ5923的耐药基因高表达，而纳米颗粒与抗生素联用可显著下调耐药基因表达。这证实了纳米颗粒通过抑制耐药基因表达来逆转抗生素耐药性的新机制。

γ辐照增强合成

1000 Gy γ辐照使菌株合成Se-NPs和ZnO-NPs的效率分别提高至85.87%和75.98%，较未辐照对照提升约三倍。这表明辐照诱变可有效增强真菌代谢产物合成能力，为规模化生产提供技术支撑。

该研究成功建立了一种基于内生真菌的纳米颗粒绿色合成平台，证实生物合成Se-NPs和ZnO-NPs具有多重生物活性：一方面通过下调耐药基因表达和破坏细胞膜完整性发挥协同抗菌作用；另一方面通过诱导癌细胞凋亡呈现选择性细胞毒性。γ辐照技术的应用进一步提高了合成效率，解决了生物合成产量低的瓶颈问题。这项研究不仅为克服抗生素耐药性提供了新策略，也为纳米药物的绿色制造提供了可持续生产模式，在生物医学和纳米技术领域具有重要应用前景。