SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶（PLpro）Ubl结构域调控机制的结构与功能解析及其抗病毒治疗意义

本研究针对SARS-CoV-2 PLpro中Ubl结构域功能未知的问题，通过分子动力学模拟、酶动力学分析和结构生物学技术，揭示Ubl结构域通过稳定ridge helix等关键区域调控PLpro催化效率的分子机制，发现游离泛素可通过非经典结合位点增强酶活性的新现象，为开发靶向PLpro变构位点的抗病毒药物提供了重要理论依据。

　　

在新冠病毒持续演变的背景下，病毒编码的非结构蛋白成为抗病毒治疗的重要靶点。其中木瓜样蛋白酶（Papain-like protease, PLpro）因其在病毒复制和免疫逃逸中的双重功能备受关注——它既能切割病毒多聚蛋白释放非结构蛋白，又能通过去泛素化（Deubiquitination）和去ISG化（DeISGylation）作用拮抗宿主天然免疫。然而长期以来，PLpro氨基末端的泛素样（Ubl）结构域的功能却笼罩在迷雾之中：这个与泛素具有17%序列同源性的结构域，在已知的底物复合物结构中并不直接参与结合，但某些抑制剂却选择性地结合在Ubl与催化结构域的界面，这暗示着其可能隐藏着不为人知的调控功能。

为了揭开Ubl结构域的神秘面纱，Rimanshee Arya等研究人员开展了一项多角度解析研究。他们发现移除Ubl结构域虽然不会使酶完全失活，却会显著降低其对三种不同底物（肽段底物Z-RLRGG-AMC、泛素底物Ub-AMC和ISG15底物ISG15-AMC）的催化效率，这提示Ubl结构域可能通过变构机制调控催化活性。更有趣的是，游离泛素分子不仅没有像预期那样竞争性抑制酶活性，反而意外地增强了PLpro的去泛素化和去ISG化活性，这表明泛素可能存在非经典结合位点，为PLpro的调控机制增添了新的层次。

这项发表于《Biology Direct》的研究综合运用了分子动力学模拟（Molecular dynamics simulations）、酶促动力学分析（Steady-state kinetic analyses）、差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry, DSF）、动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）和X射线晶体学（分辨率达1.82 ?）等技术手段。研究人员通过大肠杆菌系统表达并纯化了野生型PLpro和缺失Ubl结构域的截短突变体（PLpro TR），并利用荧光底物酶活检测、热稳定性分析、分子对接（ClusPro服务器）等多种实验方法开展了系统性研究。

结构分析揭示Ubl与催化结构域的精细互作网络

研究人员解析的PLpro WT晶体结构（PDB ID: 9VAO）显示，催化结构域形成独特的椅式结构，其中ridge helix（残基61-68）作为靠背，base helix（残基71-91）作为底座，而Ubl结构域则稳定地坐落在这个结构平台上。两个结构域之间的界面面积约708 ?2，通过氢键和范德华力相互作用形成稳定连接。特别重要的是，研究人员发现了三条从Ubl结构域延伸到催化中心的氢键网络（称为"trail"）：Trail 1从Ubl的Asp37出发，最终连接到活性位点附近的Trp106；Trail 2始于Val11和Tyr56，同样终止于Trp106；Trail 3则从His17和Asp12直接通向催化核心Cys111。这些结构特征为理解Ubl结构域如何远程调控催化活性提供了分子基础。

分子动力学模拟显示Ubl缺失增加关键区域柔性

通过100 ns的分子动力学模拟发现，虽然PLpro TR的整体结构保持稳定，但其ridge helix区域（残基61-68）的柔性显著增加。这一区域正是Ubl结构域主要相互作用的区域，其柔性增加可能会破坏那些连接Ubl与催化中心的氢键网络。同时，负责底物进入和结合的BL2 loop（残基266-271）也表现出不同的动态特性。特别值得注意的是，在Trail 2和Trail 3中的关键残基（如Tyr71和Met84）在TR变体中波动性更大，这与之前报道的突变研究结果一致——这些位点的突变会显著影响PLpro活性。

酶学特性研究揭示变构调控机制

酶动力学分析表明，PLpro TR的催化效率（k_cat/K_m）普遍降低，主要原因是k_cat值的下降而非K_m值的改变。这种催化效率的降低在Z-RLRGG-AMC和Ub-AMC底物上更为明显，而在ISG15-AMC底物上则相对较弱。研究人员推测这可能是因为ISG15的远端结构域能够与ridge helix相互作用，在一定程度上补偿了Ubl结构域缺失造成的影响。这一发现揭示了底物特异性在PLpro调控中的重要性。

游离泛素意外激活酶活性的新发现

最令人意外的发现是，游离泛素不仅没有抑制PLpro活性，反而增强了其去泛素化和去ISG化活性。分子对接分析发现了四个潜在的泛素结合位点（除已知的SUb1和SUb2位点外），其中一个位点与已报道的泛素变体结合位点（PDB ID: 8CX9）重叠。这一发现表明PLpro可能通过多个泛素结合位点接受变构调控，这与其他去泛素化酶中观察到的协同激活机制相似。

抑制剂结合特性不受Ubl缺失影响

尽管MD模拟显示BL2 loop柔性增加，但著名的PLpro抑制剂GRL0617（靶向S3-S4口袋）对WT和TR变体的结合亲和力（K_D值分别为1.9 μM和1.6 μM）和抑制 potency（IC₅₀值分别为1.3 μM和1.5 μM）几乎相同。这表明Ubl结构域的缺失虽然影响催化效率，但并不改变活性口袋的结构完整性。

本研究系统阐明了SARS-CoV-2 PLpro中Ubl结构域通过稳定ridge helix和维持氢键网络来调控催化效率的分子机制，揭示了这种变构调控的精细性和复杂性。研究发现Ubl结构域的缺失会增加关键区域的柔性，破坏从Ubl到活性中心的通信网络，从而降低催化效率。同时，研究还发现了游离泛素通过非经典结合位点增强PLpro活性的新现象，这为了解去泛素化酶的变构调控提供了新视角。这些发现不仅深化了对冠状病毒PLpro功能机制的理解，也为开发靶向PLpro变构位点的新型抗病毒药物提供了重要理论基础，特别是在当前新冠病毒持续演变的背景下，针对保守调控位点的药物设计可能具有更广泛的抗病毒效果。