苹果与柿子树间作通过调控叶内微生物与根际群落抑制根腐病的机制研究

本研究针对全球苹果产业受根腐病严重制约的问题，通过高通量测序技术分析了苹果与柿子树间作对叶内微生物和根际菌群的影响。研究发现间作可显著降低根腐病发生率（相对防效达80.3%），并揭示病原侵染导致叶内Pantoea和Serratia等有害菌富集，而间作能维持有益菌Bacillus和Trichoderma的丰度，为通过微生物调控实现绿色病害防控提供了新策略。

　　

在全球苹果产业发展中，根腐病已成为严重威胁苹果生产的重大障碍。由多种病原真菌如白纹羽病菌（Rosellinia necatrix）、齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）、紫纹羽病菌（Helicobasidium mompa）、镰刀菌（Fusarium spp.）和蜜环菌（Armillaria mellea）等引起的根腐病，导致树木生长发育异常，产量和品质显著下降。近年来，随着苹果种植面积的不断扩大和果园生态环境的恶化，根腐病发生日趋严重，已成为苹果生产中的突出问题。传统的防治措施主要依赖化学杀菌剂（如噻吩甲基、多菌灵等）和抗病砧木，但化学农药不仅带来残留、环境危害和病原抗性等问题，还可能破坏土壤中有益微生物群落的结构和功能。同时，由于根腐病病原复杂、抗病表型难以观察，利用砧木抗性防治根腐病的研究进展也十分有限。在这一背景下，利用植物内生细菌和根际微生物调控植物健康成为新的研究方向。植物多样性的提高能够增强生态系统功能的稳定性，间作种植模式被证明可有效降低作物病害的发生。在这一背景下，研究人员偶然发现，在患有根腐病的苹果园中种植柿子树后，苹果根腐病的发生率显著下降，这一现象引发了深入研究。

为探究间作调控微生物群落防控根腐病的机制，研究人员在2016年至2021年间于中国云南省昆明市团结乡苹果基地开展田间试验。试验以2016年种植的红富士苹果（Malus × domestica）和2018年种植的次郎柿（Diospyros kaki ‘Jiro’）为材料，通过设置健康苹果树、根腐病苹果树、柿子树以及苹果与柿子间作区的不同处理，采集叶片和根际土壤样本。利用Illumina MiSeq平台进行高通量测序，分析叶内细菌内生群落和根际微生物（包括细菌和真菌）的组成与结构。通过生物信息学分析比较不同处理间微生物多样性、群落结构及关键微生物类群的差异，并结合统计学方法验证组间差异的显著性。

主要技术方法包括：（1）样本采集：按健康苹果叶（HAL）、根腐病苹果叶（DAL）、柿树叶（PL）、间作苹果叶（ApL）和间作柿叶（PaL）分组采集叶片；按健康苹果根际土壤（HASB/DASB/PSB/APSB用于细菌；HASF/DASF/PSF/APSF用于真菌）采集根际土壤，所有样本设3次重复；（2）DNA提取与扩增：叶片样本采用CTAB法提取DNA，土壤样本使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit提取DNA，分别针对细菌16S rRNA基因V5-V7/V3-V4区域和真菌ITS1区域进行PCR扩增；（3）测序与数据处理：使用Illumina MiSeq平台进行测序，通过FLASH和fastp进行序列质量控制与拼接，UPARSE以97%相似度聚类OTU，RDP Classifier进行物种注释；（4）统计分析：使用Majorbio Cloud平台计算Alpha多样性（Chao1、Shannon指数等）和Beta多样性（PCoA分析），并通过Wilcoxon检验和PERMANOVA分析组间差异。

研究结果揭示如下：

质量控控和测序数据分析

通过对叶片和根际土壤样本的高通量测序，共获得612,606条叶片细菌高质量序列，772,169条根际细菌16S rRNA基因序列和841,011条真菌ITS1序列。稀释曲线表明测序深度足够覆盖微生物多样性。PCoA分析显示，不同处理间微生物群落结构存在显著差异（p < 0.007），表明苹果树在健康、患病和间作条件下主动招募了不同的微生物群落。

共享和独有微生物群落

Venn图分析显示，健康苹果叶（HAL）的OTU数量最高（279），根腐病苹果叶（DAL）最低；根际细菌OTU在4组土壤样本间共享1822个OTU，但各有独有OTU（如HASB有79个独有OTU）。间作处理增加了微生物群落的丰富度和独特性。

门水平群落结构差异

叶片中优势菌门为变形菌门（Proteobacteria，占89%以上），根腐病苹果叶中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）比例最低。根际土壤中，酸杆菌门（Acidobacteriota）在根腐病苹果根际（DASB）中比例不足其他样本的一半，而变形菌门和放线菌门（Actinobacteria）比例较高。真菌方面，子囊菌门（Ascomycota）为优势门（占68%以上），根腐病苹果根际（DASF）中被孢霉门（Mortierellomycota）比例较低，担子菌门（Basidiomycota）比例较高。

属水平群落结构及间作调控作用

叶片中假单胞菌属（Pseudomonas）在间作苹果叶（ApL）中比例最高（58.82%），根腐病苹果叶（DAL）中Pantoea和Serratia比例显著升高（p < 0.05）。根际土壤中，链霉菌属（Streptomyces）和芽孢杆菌属（Bacillus）在健康苹果和间作处理中比例较高，而根腐病苹果根际中比例显著降低（p < 0.05）。真菌中，被孢霉属（Mortierella）和Gibberella在根腐病苹果根际中比例较低，Scedosporium和Arthroderma比例较高。间作处理能够调节这些关键属的丰度，恢复微生物群落平衡。

差异微生物类群分析

根腐病苹果叶中Pantoea（p < 0.001）和Serratia（p < 0.03）显著富集，链霉菌属（Streptomyces）显著减少（p < 0.02）。根际土壤中，芽孢杆菌属（Bacillus）和酸杆菌属（Acidibacter）在健康苹果根际中比例较高，而根腐病苹果根际中Romboutsia和Nocardia比例较高。间作处理显著提高了有益菌如链霉菌属和芽孢杆菌属的丰度，降低了有害菌的比例。

研究结论与讨论部分指出，苹果与柿子树间作通过调控叶内微生物和根际群落结构，显著降低了根腐病的发生率。间作处理能够维持有益微生物（如Bacillus和Trichoderma）的丰度，抑制有害菌（如Pantoea和Serratia）的繁殖，从而恢复微生物群落平衡。这一发现为通过植物多样性种植模式调控微生物群落、实现绿色可持续的病害防控提供了重要理论依据和实践策略。该研究不仅揭示了根腐病发生与微生物群落失衡的关系，还为果园生态系统管理提供了新思路，有助于减少化学农药使用，提高果园生产的经济和生态效益。论文发表于《BMC Plant Biology》，对推动植物微生物组在农业中的应用具有重要意义。