Tubacin通过增强微管稳定性缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠卵母细胞和受精卵的生殖毒性

本研究针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)引起的生殖毒性问题，研究人员开展了HDAC6抑制剂Tubacin对卵母细胞成熟影响的机制研究。结果表明Tubacin通过增强微管乙酰化稳定纺锤体结构，成功挽救DON诱导的减数分裂阻滞和受精卵分裂异常。该研究不仅揭示了DON生殖毒性的新机制，还建立了人源化TUBB8卵母细胞特异性敲入模型，为环境污染物生殖风险评估提供了重要平台。

　　

在全球粮食安全面临严峻挑战的背景下，真菌毒素污染已成为不可忽视的公共卫生问题。其中，镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)作为最常见的粮食污染物，因其卓越的热稳定性和化学稳定性，能够通过食物链不断生物富集，对哺乳动物生殖系统造成严重威胁。越来越多的流行病学证据表明，DON暴露与生殖功能损伤密切相关，包括早产、宫内生长受限和不孕症风险增加等问题。

尽管先前研究已发现DON会破坏卵巢类固醇生成，抑制颗粒细胞增殖和性激素合成，并直接通过纺锤体组装缺陷和错误的动粒-微管附着损害卵母细胞质量，但其分子机制仍不清楚。更为复杂的是，人类与小鼠卵母细胞在成熟过程中存在根本性差异：人类卵母细胞的微管成核主要由进化上独特的人类微管组织中心(huoMTOCs)协调，而小鼠则主要依赖微管组织中心(MTOCs)。这种物种差异使得传统动物模型难以准确模拟DON对人类卵母细胞的影响。

针对这些挑战，南京医科大学冯瑞芝团队在《Cell Communication and Signaling》上发表了一项突破性研究，系统地探讨了DON诱导卵母细胞减数分裂失败的机制，并发现组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)抑制剂Tubacin能通过增强微管稳定性有效缓解DON引起的生殖毒性。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：通过体外卵母细胞培养体系进行抑制剂处理实验；利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术分析纺锤体结构和细胞器分布；采用Smart-seq2 RNA测序技术进行转录组分析；构建了TUBB8卵母细胞特异性敲入小鼠模型模拟人类微管特性；通过分子对接分析DON与微管蛋白的相互作用机制；使用荧光探针评估活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位变化。所有实验均使用3-5周龄雌性小鼠的卵母细胞，符合南京医科大学动物伦理委员会 guidelines。

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Tubacin缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露引起的小鼠卵母细胞成熟阻滞

研究人员首先探讨了DON对小鼠卵母细胞成熟的影响，发现在体外成熟培养基中添加不同浓度DON(1、2、3和6μM)后，极体挤出(PBE)率呈剂量依赖性下降。2μM DON处理组已显示统计学显著减少，而6μM DON则完全诱导减数分裂阻滞。当使用HDAC6特异性抑制剂Tubacin进行共处理后，PBE率和减数分裂失败得到显著恢复。免疫荧光分析显示，对照卵母细胞呈现典型的桶状纺锤体结构，染色体整齐排列在赤道板上，而DON暴露的卵母细胞出现严重的纺锤体解体和染色体错误排列。Tubacin共处理恢复了正常的纺锤体形态和染色体排列。

研究人员进一步通过多色免疫荧光成像系统表征了微管组织中心(MTOCs)相关蛋白的空间分布。在对照卵母细胞中，Pericentrin和γ-Tubulin在纺锤体极处呈现紧密聚焦的信号，而DON暴露导致这些MTOC标记物分散，显示异常分布模式或表达量减少。这种缺陷被Tubacin共处理有效挽救。通过DCFH-DA荧光测定发现，DON暴露的卵母细胞细胞内活性氧(ROS)信号显著升高，而Tubacin恢复了DON处理损害的线粒体膜电位和ATP水平，表明线粒体功能得到恢复。

DON诱导微管不稳定的机制见解

为了研究DON诱导的细胞骨架改变，研究人员对关键的微管动力学调节因子和纺锤体组装因子进行了免疫荧光分析。微管成核因子TPX2的荧光强度在DON暴露的卵母细胞中显著降低，而Tubacin共处理将TPX2的定位模式恢复到对照水平。值得注意的是，在DON处理的卵母细胞中观察到纺锤体稳定因子KIF11的异常细胞质积聚，这种现象被Tubacin补充剂所挽救。分子对接显示DON可能与α/β-微管蛋白二聚体的内部多个位点结合，表明其结构干扰了微管聚合动力学和微管稳定性。

考虑到KIF11在微管稳定中的核心作用，研究人员进行了冷诱导分解实验以评估微管韧性。经过10分钟冷处理后，DON暴露的卵母细胞中耐冷微管晶格和纺锤体长度显著减少，而Tubacin共处理保持了微管稳定性。一致地，DON暴露的卵母细胞中乙酰化α-微管蛋白水平显著降低，Tubacin将微管乙酰化恢复到正常水平。

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Tubacin在TUBB8卵母细胞特异性敲入小鼠模型中保护 against DON诱导的缺陷

人类卵母细胞中的减数分裂纺锤体组装和结构稳定性的维持主要由灵长类特异性基因TUBB8编码的微管介导，而小鼠纺锤体组装主要依赖微管组织中心(MTOCs)。这种种间差异强调了需要能更忠实复制人类生殖生理学的实验模型。研究人员因此构建了TUBB8卵母细胞特异性敲入(TUBB8-KI)小鼠模型。

DON暴露在敲入卵母中重现了减数分裂缺陷，而Tubacin显示出与野生型对照相当的挽救效果。对照卵母细胞和TUBB8-KI卵母细胞在纺锤体形态或成熟率方面没有显著差异，确立了其用于人类相关生殖毒性评估的可靠性。机制分析表明，DON暴露消除了MTOC相关成分的极化分布，Pericentrin和DCTN1分别呈现弥漫性细胞质定位或表达减少。Tubacin治疗有效挽救了它们的特征性双极富集。此外，观察到的DON诱导的KIF11抑制与双极纺锤体形成受损相关。Tubacin干预不仅使KIF11表达水平正常化，而且重新建立了其典型的双极定位模式。

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DON暴露抑制卵母细胞中的mRNA翻译

通过低输入Smart-seq2分析表征了DON在成熟卵母细胞中诱导的转录改变。Spearman相关分析显示实验组明显分离，具有高度的重复间一致性。DON暴露诱导了432个差异表达基因(DEGs，416个上调和16个下调)，而Tubacin共处理将DEGs减少到112个(49个上调和63个下调)，证明通过微管稳定化部分恢复了转录稳态。

结构分析表明DON与核糖体60S亚基内肽基转移酶中心(PTC)的高亲和力结合，为肽键形成受损和翻译延伸过程提供了证据。GO富集分析确定了DON暴露卵母细胞中细胞骨架调节因子和线粒体/核糖体成分的显著转录抑制。值得注意的是，细胞骨架相关效应因子包括微管动力学控制器(Tuba4a、Cdk5rap2、Stau2)和肌动蛋白丝组织者(Unc45a、Ccdc60、Reps2)在DON暴露后显著上调，而细胞器相关的DEGs包括线粒体转运蛋白(Prkag2、Slc25a54、Timm50、Tor1b、Mpv17l)和核糖体生物发生因子(Rbm41、Gpn1、Rpl36al、Eif3l、Nalf2)在DON诱导的卵母细胞中显著升高。

基因集富集分析(GSEA)显示上调基因富集在核糖体功能，下调基因与泛素介导的蛋白水解相关，表明DON可能影响核糖体mRNA翻译和泛素依赖性降解途径。Tubacin补充后，差异表达基因在染色体分离生物过程中富集，这与DON诱导的成熟阻滞卵母细胞中大多数DEGs富集在不对称分裂相关细胞周期进程相一致。

DON暴露导致合子迁移和分裂异常

通过原核迁移和分裂分析研究了DON暴露后受精卵的发育能力。观察到2细胞胚胎形成的剂量依赖性损伤，受精卵对DON毒性比GV期卵母细胞更敏感。3μM DON完全导致分裂阻滞，而2μM Tubacin将2细胞率恢复到62.5%。通过量化关键标志物包括Muervl、Hsp70.1、eIF1A和Zscan4d的表达进一步评估了合子基因组激活(ZGA)的激活。Tubacin有效逆转了DON诱导的Muervl、eIF1A和Zscan4d失调，证实了其在早期胚胎发生过程中保护表观遗传重编程的作用。

进一步研究发现细胞骨架破坏和微管乙酰化缺陷。Tubacin干预特异性恢复了乙酰化微管密度，改善了分裂率以及F-肌动蛋白数量和模式，确立微管稳定性作为发育能力的主要决定因素。通过药理学乙酰化增强实现的部分挽救将微管翻译后修饰确定为消除霉菌毒素诱导发育阻滞的关键治疗靶点。

研究结论与意义

本研究确立了微管稳定性作为HDAC6抑制剂Tubacin挽救DON诱导的女性生殖毒性的主要机制。通过整合药理学干预和人性化生理模型，首次证明了人源化TUBB8卵母细胞特异性敲入小鼠模型中DON通过协调降低α-微管蛋白乙酰化和MTOC解聚破坏纺锤体架构。这种组合方法独特地弥合了物种特异性转化差距，证明Tubacin治疗恢复乙酰化水平并挽救极体挤出效率，将微管稳定定位为卵母质量挽救的关键治疗策略。

配子特异性DON毒性可能源于控制减数分裂进程的独特不对称分裂。与体细胞毒性机制不同，在卵母细胞中2μM DON降低乙酰化α-微管蛋白水平，从而增加纺锤体缺陷。合子细胞骨架网络表现出更高的敏感性，3μM DON通过原核迁移失败和细胞骨架破坏诱导完全分裂阻滞，表明发育阶段依赖性脆弱性。

作为特异性HDAC6抑制剂，Tubacin通过增加α-微管蛋白乙酰化增强微管稳定性。研究表明，Tubacin对卵母细胞成熟和纺锤体组装与维护有积极影响。本研究揭示Tubacin治疗显著恢复DON暴露卵母细胞中的微管乙酰化和纺锤体稳定。乙酰化α-微管蛋白组装在稳定的微管结构内，以增强细胞对低温暴露和药理学干预的韧性。

该研究的综合发现阐明了Tubacin对DON诱导的卵母细胞生殖毒性的挽救效应，并验证了TUBB8卵母细胞特异性敲入小鼠模型作为评估环境污染物和女性生殖潜在治疗的生理相关平台。这些发现不仅为理解DON生殖毒性机制提供了新见解，而且为开发针对环境污染物引起的生殖障碍的治疗策略提供了重要方向。